HPLC法同时测定不同栽培区域滁菊中8种成分含量

孙婷婷， 魏雅平， 程 红， 冯 慧， 王 祥， 褚天亮， 叶明君， 俞 浩

(安徽科技学院 生命与健康科学学院，安徽 凤阳 233100)

滁菊(Dendranthemamorifolium(Ramat) Tzvel. cv. Chuju)为菊科植物菊的干燥头状花序，滁菊因栽培历史悠久、品质优良而驰名全国，其药用价值位列四大白菊之首，为著名道地药材[1]。当前，滁菊产业已成为滁州市地方支柱产业，对带动当地农民增收致富有重大意义。现代研究表明，滁菊富含黄酮[2]、酚酸[3]、挥发油[4]、氨基酸和微量元素等多种成分[5]，具有抗氧化[6]、抗病毒[7]、镇痛[8]、降压[9]、保护大鼠脑缺血再灌注损伤[10]等多种功能。本试验利用HPLC法同时测定不同栽培区域中滁菊中绿原酸[11]、木犀草苷[12]、异绿原酸A、异绿原酸C[13]、黄芩苷[14]、槲皮素[15]、木犀草素[16]、芹菜素[17]等8 种成分的浓度，以期为滁菊药材的质量控制提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

高效液相色谱仪(日本岛津有限公司)；AP-01P真空泵(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)；SHZ-DⅢ循环水真空泵(郑州英峪予华仪器有限公司)；CP225D准微量天平(德国赛多利斯公司)；DHG-9101-2SA型电热恒温鼓风干燥箱(上海三发科学仪器有限公司)；TZ520130204离心机(湖南易达京华仪器有限公司)。

滁菊药材样品分别采自滁州市全椒县复兴乡复兴村、周岗乡大庄村、滁州市南谯区城郊乡城西村中郢、南谯区施集镇明张村、南谯区大柳镇广卫村、中国滁州菊花博览园，及安徽科技学院中药科技园等7个不同栽培区域中。绿原酸(含量≥98%，批号：wkq16052705),黄芩苷(含量≥98%，批号：wkq16070503),木犀草素(含量≥98%，批号：wkq16051201)均购于四川省维克奇生物科技有限公司；槲皮素(含量≥98.5%，批号：J1226035)购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；芹菜素(含量≥98.20%，批号：15032610)，购于中国食品药品检定研究院；异绿原酸A(含量≥98%，批号：Y24N8Y49009),木犀草苷(HPLC≥98%，批号：Y05D8H49919),异绿原酸C(含量≥98%，批号：P25J6F1794)购于上海源叶生物科技有限公司。甲醇购于安徽天地高纯溶剂有限公司；乙腈(色谱纯)购于西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；其他试剂均为分析纯；试验用水为超纯水。

1.2 试验方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脱(表1)；流速：0.8 mL/min；检测波长327 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL。

表1 梯度洗脱条件

1.2.2 混合标准品溶液的制备 精密称定绿原酸、木犀草苷、异绿原酸A、异绿原酸C、黄芩苷、槲皮素、木犀草素、芹菜素标准品各1.0 mg，经70%甲醇溶解后，定容于10 mL容量瓶中，超声20 min，得出0.10 mg/mL的标准品储备液。分别吸取不同体积的溶液制成混合标准品溶液，于4 ℃冰箱保存。各标准品浓度见表2。

表2 混合标准品各成分浓度

1.2.3 滁菊检测样品溶液的制备 取不同栽培区域滁菊，干燥后粉碎，过一号筛，得滁菊粗粉。精密称定滁菊粗粉0.25 g，置具塞锥形瓶中，加入70%甲醇25 mL，称定重量。超声处理(功率300 W，频率45 kHz)40 min，静置冷却后再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，置4 ℃冰箱保存待测。检测时用0.45 μm微孔滤膜滤过。

1.3 测定项目及分析方法

1.3.1 线性关系考察 取1.2.2节下配制的混合标准品溶液，分别进样3、6、9、12、15 μL，按1.2.1节下方法测定，以峰面积(Y)为纵坐标，标准品质量(X)为横坐标，绘制各标准品标准曲线。

1.3.2 专属性考察 分别取1.2.2节下混合标准品溶液和1.2.3节下滁菊样品溶液10 μL进样，测定标准品溶液各成分保留时间、滁菊样品溶液中绿原酸、木犀草苷、异绿原酸A、异绿原酸C、黄芩苷、槲皮素、木犀草素、芹菜素的保留时间及各峰分离程度(图1)。

1.3.3 精密度测定 取1.2.2节下混合标准品溶液，精密吸取10 μL，注入液相色谱仪，按照1.2.1节下色谱条件进行分析，连续重复进样6 次，以绿原酸、木犀草苷、异绿原酸A、异绿原酸C、黄芩苷、槲皮素、木犀草素、芹菜素吸收峰峰面积积分值，计算RSD值分别为1.91%、1.78%、2.56%、0.97%、0.67%、0.64%、1.09%、2.40%。

1.3.4 稳定性测定 取1.2.3节下中国滁州菊花博览园检测样品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h进样，以绿原酸、木犀草苷、异绿原酸A、异绿原酸C、黄芩苷、槲皮素、木犀草素、芹菜素的峰面积，计算RSD值分别为0.31%、0.61%、1.64%、0.66%、1.66%、0.23%、0.29%、2.10%。

1.3.5 重复性试验 取中国滁州菊花博览园样品6份，精密称定0.25 g，按1.2.3节下制备检测样品溶液，按1.2.1节下色谱条件进样，以绿原酸、木犀草苷、异绿原酸A、异绿原酸C、黄芩苷、槲皮素、木犀草素、芹菜素峰面积，计算RSD值分别为1.20%，1.94%，0.52%，2.01%，1.70%，1.26%，1.16%，1.31%。

1.3.6 加样回收率测定 精密称定已知含量的滁菊药材粉末6 份，每份约0.125 g，分别精密加入已知量混合标准品溶液，按1.2.3节下操作制备检测样品溶液，进样10 μL，计算平均加样回收率。

2 结果与分析

2.1 方法学考察结果

建立上述HPLC检测方法，同时测定混合标准品溶液中绿原酸、木犀草苷、异绿原酸、异绿原酸C、黄芩苷、槲皮素、木犀草素、芹菜素8种成分峰面积，分别建立8条线性关系(表3)。在相应线性范围内，其相关系数均在0.999以上，结果表明建立的线性关系良好，可用于滁菊检测样品溶液中绿原酸、木犀草苷、异绿原酸A、异绿原酸C、黄芩苷、槲皮素、木犀草素、芹菜素8种成分的定量检测。

测定混合标准品溶液和滁菊样品溶液中绿原酸、木犀草苷、异绿原酸A、异绿原酸C、黄芩苷、槲皮素、木犀草素、芹菜素的保留时间及各峰分离程度，如下图所示，结果表明混合标准品溶液中与滁菊检测样品溶液中各成分保留时间基本一致，各峰分离程度良好，表明该试验方法专属性良好，可用于滁菊中上述8种成分同时检测。

表3 线性关系

图1 混合对照品(A)与滁菊样品(B)HPLC图

精密称定已知含量的中国滁州菊花博览园滁菊药材粉末6 份，每份约0.125 g，分别精密加入已知量混合标准品溶液，按1.2.3节下操作制备检测样品溶液，进样10 μL，计算平均加样回收率(表4)。结果表明，平均回收率在94.57%～100.01%之间，RSD均小于3%，表明该方法回收率良好。

表4 加标回收试验(n=6)

续表4 Table 4 continued

2.2 含量测定结果

取1.2.3节下7个不同栽培区域滁菊检测样品溶液，每个样品平行制备2份，按1.2.1节色谱条件进样检测，进样10 μL，得不同栽培区域滁菊中绿原酸、木犀草苷、异绿原酸A、异绿原酸C、黄芩苷、槲皮素、木犀草素、芹菜素HPLC色谱图(图2)，以不同栽培区域不同成分峰面积带入标准曲线方程，即得。含量测定结果见表5。

表5 不同栽培区域滁菊含量测定结果

图2不同栽培区域滁菊HPLC色谱图

Fig.2 HPLC chromatogram of ChuChrysanthemumin different cultivated areas

3 结论与讨论

近年来，多位学者报道了同时测定滁菊及其他药用菊花多种化学成分的方法。王月茹等建立了HPLC法测定菊花药材中10 种主要化学成分的含量，作为中药菊花的质量控制的有效方法,为明确不同品种菊花的基原关系和品种鉴定研究提供了数据基础[12]；屠万倩等建立HPLC法同时测定不同产地菊花中新绿原酸、绿原酸、异绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、木犀草素等8 种成分的含量[13]，丰富了菊花的含量测定方法, 更科学、更全面的评价菊花的内在质量；黄艳梅等在“HPLC结合化学计量学对不同产地菊花中化学成分的比较分析”中对滁菊进行了多达14 种成分(绿原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、1,3-O-二咖啡酰奎宁酸、木犀草素、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、槲皮苷、芹菜素、黄芩苷、芦丁、咖啡酸、蒙花苷、香叶木素)分析[14]，建立一种分析药用菊花中14个成分的HPLC方法,并结合化学计量学方法对不同产地菊花的化学成分进行比较分析。滁菊为著名道地药材，已成为菊花品种中不可或缺的一部分，目前，HPLC法已常用于菊花的质量控制研究，但HPLC法同时测定不同栽培区域滁菊中多种成分含量尚未见报道，因此，研究不同栽培区域滁菊中多种成分含量很有必要。本试验采用HPLC法，建立了同时测定滁菊中绿原酸、木犀草苷、异绿原酸A、异绿原酸C、黄芩苷、槲皮素、木犀草素、芹菜素8种成分含量的方法。

本试验最终确定流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液，以及最佳洗脱梯度(见表1)；流速：0.8 mL/min；检测波长327 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL。通过对该方法进行精密度、稳定性、重复性、加样回收率考察，表明该方法简便准确、精密度高、重现性好、平均回收率高。该方法可用于同时测定滁菊中绿原酸、木犀草苷、异绿原酸A、异绿原酸C、黄芩苷、槲皮素、木犀草素、芹菜素8种成分含量，对滁菊质量控制具有重要意义。

通过对不同栽培区域滁菊的含量测定，各生长区域绿原酸、木犀草苷、异绿原酸A均明显高于药典标准。但不同生长区域之间成分含量存在明显差异，其中绿原酸含量最高的为中国滁州菊花博览园；木犀草苷含量最高的是周岗乡，其次为中国滁州菊花博览园；异绿原酸A、异绿原酸C含量最高的均为中国滁州菊花博览园；黄芩苷含量最高的为周岗乡，其次为中国滁州菊花博览园；槲皮素在各生长区域含量均较少，含量相差不大；木犀草素、芹菜素均以城郊乡含量最高，且与其他栽培区域相差较大。试验结果说明不同栽培区域的滁菊化学成分含量差异较大，造成含量差异的原因，以及成分与功效的相关性等相关问题有待进一步深入研究。