Polo样激酶5在调控细胞周期参与肾透明细胞癌进展和转移的研究

梁 波,章晓军,杨振兴

(1.象山县第一人民医院泌尿外科，浙江宁波 315700；2.陆军军医大学第二附属医院泌尿外科，重庆 400037)

近年来，随着经济发展和医疗水平的提高，肾癌的发病率(66.8/100 000)和致死率(23.4/100 000)也在增加，其中大部分是肾脏细胞癌，而肾脏细胞癌中又以透明细胞癌占大多数[1]。目前，大部分肾癌患者的诊断都是通过体检发现，然后再辅助精确的病理检查，虽然局限性肾癌超过50%，但是仍然有30%的肾癌患者在诊断时就已经转移[2-3]。Polo样激酶(PLK)是参与有丝分裂进入与退出，纺锤体形成，胞质分裂和减数分裂细胞周期调节的一类激酶，在果蝇、萌芽酵母和裂殖酵母的基因组中仅发现一个PLK表达。然而，脊椎动物有许多PLK家族成员，包括PLK1、PLK2、PLK3、PLK4和PLK5。在脊椎动物PLK家族成员中，哺乳动物PLK1已被广泛研究[4]。人类PLK5基因也是最近发现的参与细胞周期循环的关键激酶，在人类神经元分化和肿瘤形成中发挥重要作用[5]。并且，最近的研究显示PLK5调控细胞周期参与肾脏透明细胞癌的淋巴结转移[5-6]。因此，本研究将探索PLK5蛋白参与肾脏透明细胞癌发生和进展的作用机制，旨在阐述PLK5可能对肾癌转移产生的潜在影响，并可能成为后续临床用药和治疗的靶点。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 所有肾癌组织标本均来自象山县第一人民医院和陆军军医大学第二附属医院，参与患者均被告知参与研究，并且通过医院伦理委员会批准。肾透明细胞癌细胞系购自上海中乔新舟生物科技有限公司；CCK-试剂盒购自日本同仁化学公司；1640培养基购自美国Gibco公司； FITC nexinV凋亡检测试剂盒购自美国BD公司；PLK5抗体购自CST公司。

1.2方法

1.2.1实时荧光定量PCR 细胞和组织RNA的提取，在使用TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2 mL氯仿剧烈振荡管体15 s，15～30 ℃孵育2～3 min，4 ℃下12 000 r/min离心15 min。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相、中间层及无色水相上层。加入异丙醇沉淀和提取，分离保存RNA。运用SYBR Green染料试剂盒，按照操作说明进行实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测。

1.2.2蛋白质免疫印迹法(Western blot) 采用Western blot检测PLK5蛋白表达情况，步骤如下:分别收集肾癌细胞系和组织标本，使用预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗后加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂，冰浴20 min。离心，收集上清液，采用二喹啉甲酸法(BCA)测定蛋白水平。各组取等量总蛋白加上样缓冲液，煮沸变性5 min，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。然后转移到硝酸纤维素膜上，10%脱脂奶粉封闭1 h，将对应相对分子质量条带剪下后分别用一抗PLK5在4 ℃孵育过夜后，加相应二抗孵育1 h，膜上滴加化学发光剂在暗室进行曝光显影。

1.2.3免疫组织化学染色 组织标本免疫组织化学染色步骤如下:切片常规脱蜡，缓冲液PBS洗3次，每次5 min，将切片放在 Hydrogen Peroxide Block中孵育10～15 min，缓冲液洗3次，每次5 min。加入4%多聚甲醛固定20 min，弃4%多聚甲醛后用PBS洗涤2次，滴加一抗工作液37 ℃孵育1～2 h，或抗CX43抗体的PBS-BSA (1∶200) 孵育，4 ℃过夜。向1 mL DAB Plus Substrate(或AEC Plus Substrate)中滴加1～2滴DAB Plus Chromogen(或AEC Plus Chromogen)，混匀后滴加到切片上，孵育3～15 min。滴加适量的辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素工作液，37 ℃孵育10～30 min，显色剂显色3～15 min(DAB或NBT/BCIP)，锡箔纸包裹置于37 ℃温箱孵育1 h，PBS洗涤3次，每次3 min，置于激光共聚焦显微镜下观察。

1.2.4慢病毒构建和转染 慢病毒构建是由吉玛生物公司协助完成，所有肾癌细胞系培养在合适的培养基中，含10%胎牛血清，在37 ℃、5% CO2及饱和湿度的培养箱中进行孵育培养。六孔板细胞没空感染20 mL慢病毒，24 h以后观测荧光强度，进行后续试验。

1.2.5CCK-8检测和划痕实验 CCK-8检测使用购买自碧云天的CCK8试剂盒，取对数生长期的上述肾癌细胞经胰酶消化细胞计数后，按每孔3 000个细胞接种于96孔板中，每组设3个复孔。加入90 μL 1640培养基和10 μL CCK-8试剂，放细胞培养箱孵育1 h后，用酶标仪测450 nm波长各孔吸光度值。划痕实验具体步骤:先用marker笔在6孔板背后均匀地划横线；在孔中加入约5×105个细胞，具体数量因细胞种类不同而不同；PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，加入无血清培养基培养；使用统计软件计算细胞间距离的均值。

1.2.6流式细胞仪检测细胞周期 OSRC2细胞经胰酶消化后铺6孔板，每孔2 mL培养基，生长至80%后经胰酶消化收集细胞，加入预冷的75%乙醇4 ℃固定过夜，离心收集细胞，进行流失细胞仪鉴定细胞周期改变。

2 结 果

2.1PLK5基因参与肾脏透明细胞癌的进展和预后 来自癌症数据库TCGA的RNA-seq表达数据分析表明，肾癌患者PLK5蛋白的表达明显高于健康对照组(n=145vs.n=22，P<0.01，图1A)；并且这种高表达集中在肾癌的高级阶段(阶段Ⅳ，n=84，P<0.01，图1B)；来自30对肾癌及癌旁组织的临床数据也提示PLK5在肾癌患者中高表达(P<0.01，图1C)；另外，生存分析数据也显示，PLK5高表达者预后较低表达者差(P=0.002 2，图1D)，特别是在PLK5高表达并且病理分级高的患者中生存率明显降低(P<0.01，图1E)。

2.2PLK5蛋白在肾癌细胞系和组织中的表达情况 在4种肾癌细胞系(769-P、OSRC2、786-O、Caki-2)和人正常肾脏上皮永生化细胞HK2中检测PLK5表达情况，结果显示，无论是Western blot(P<0.01，图2A)还是RT-PCR(P<0.01，图2B)实验均表明OSRC2细胞中PLK5表达较其他细胞类型高。对临床肾透明细胞癌患者的肿瘤及其癌旁组织的免疫组织化学染色发现，在肾脏透明细胞癌中PLK5主要表达于肾脏远曲小管(图2C)，且主要定位在细胞核，表达水平高，而在癌旁正常组织(图2D)PLK5蛋白表达水平低。

A:PLK5在癌组织和癌旁组织中的RNA测序结果；B:癌症不同分期PLK5的表达水平；C:收集的临床标本PLK5 mRNA表达水平；C:不同表达水平患者生存曲线；D:不同表达肿瘤级别患者生存曲线；a:P<0.01，与癌旁组织/正常组织比较
图1 PLK5与肾癌进展和预后的关系

A:Western blot检测PLK5在肾癌细胞系统的表达；B:RT-PCR检测PLK5在肾癌细胞系统的表达；C:肾脏透明细胞癌组织的免疫组织化染色；D:正常肾脏组织免疫组织化染色；a:P<0.01，与HK2细胞比较
图2 PLK5蛋白在肾癌细胞系和组织中的表达

2.3RNA干扰PLK5蛋白的效率分析 构建3种PLK5干扰病毒，分别转染肾癌细胞系OSRC2和正常肾脏上皮细胞系HK2，免疫荧光观察显示慢病毒感染效率高(>90%，图3C、D)。而结果分析显示，第3种RNA干扰标签效果最好，无论是RT-PCR(P<0.01，图3A)还是Western blot(P<0.01，图3B)实验都显示PLK5蛋白表达水平低于其他对照组。因此后续研究均以第3类干扰RNA做分析。

A:Western blot检测显示3种RNA干扰效率；B:RT-PCR检测显示3种RNA干扰效率；C:OSRC2肾癌细胞干扰RNA-3的白光；D:OSRC2肾癌细胞干扰RNA-3的荧光；a:P<0.01，与同细胞系干扰RNA-3比较
图3 RNA干扰PLK5蛋白表达的效率分析

2.4PLK5蛋白干扰明显影响肾癌细胞的表型 分析PLK5蛋白干扰以后的细胞表型，CCK8细胞增殖实验显示，干扰组较对照组OSRC2细胞48 h以后增殖明显减慢(P<0.01，图4A)，而划痕实验也证实干扰组细胞迁移速度明显减慢，24 h测量两组划痕距离有明显差异(P<0.01，图4B)。由于干扰后，OSRC2细胞增殖速度明显减慢，所以随后检测的细胞周期也发现hRNA3组细胞周期阻滞在S期(P<0.01，图4C)。

A:干扰组和对照组的CCK8增殖实验；B:干扰组和对照组的细胞划痕实验；C:干扰组和对照组的细胞周期实验；a:P<0.01，与对照组比较
图4干扰PLK5蛋白表达对肾癌细胞表型的影响

A:22对癌组织和癌旁组织基因RNA-seq表达热图分析；B:GSEA分析显示细胞循环通路中大部分基因在癌组织中被激活
图5信号通路分析

2.5PLK5蛋白通过抑制肾癌细胞的细胞周期产生作用 运用癌症TCGA数据库中癌组织和癌旁组织(22对)的RNA-seq表达数据，在软件基因组表达富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)中分析结果显示，与PLK5相互作用的蛋白(图5A)均参与了肾癌细胞的进展，这些基因均参与了细胞周期G1到S期的调控(图5B)。明显富集的细胞周期通路为细胞循环(cell cycle，P<0.01，FDRq=0.014)。

3 讨 论

在当前的研究中，前期的生物信息学分析发现PLK5蛋白在肾脏透明细胞癌患者中表达增加，尤其表现在肾癌的高级阶段的患者中，并且生存分析显示PLK5基因表达与患者预后密切相关，高表达患者预后明显较差。在接下来的分子生物学实验中，作者证实干扰PLK5基因表达可以明显干扰细胞周期S阶段，抑制肿瘤细胞增殖和迁移。

淋巴结转移是透明细胞癌最常见的转移方式，检测与转移相关的基因表达对于诊断和干预是非常有价值的[9]。尽管许多原发基因突变(如VHL、PBRM1、SETD2、BAP1等)可以导致肾癌的发生，但是哪些基因参与肾癌转移仍然未知[3]。由于肿瘤巨大的异质性，鉴定转移相关的基因比较困难[10]。越来越多的证据显示，PLK5参与肿瘤细胞的淋巴结转移，PLK5激酶是哺乳动物体内参与细胞循环的一类最重要的激酶，在小鼠NIH3T3细胞内过表达PLK5 cDNA可以明显诱导G1期静止，增加S阶段细胞循环，作为肿瘤细胞的抑制子是G1/S阶段的重要调控蛋白[5，11]。PLK5基因定位在人类染色体19p13.3，全长11.4 kb，包含14个外显子，以及PBD1和PBD2两个主要功能域，缺乏激酶活性结构域，与PLK2和PLK3有极大同源性[5，12]。PLK5蛋白主要定位在细胞核，肿瘤细胞中PLK5表达可以抑制G1期进入S阶段，并且诱导氧化应激和DNA损伤[13-14]。另外，还有研究显示，PLK5特异的甲基化调控可以在肿瘤患者体内控制PLK5表达，促进肿瘤细胞的增殖和迁移[15-16]。

本研究在肾脏细胞癌模型中检测PLK5蛋白的作用，研究显示PLK5蛋白在肿瘤细胞的表达增加可以促进肿瘤细胞增殖和迁移，与肿瘤细胞迁移有很大关联，并且信号通路分析显示，与PLK5相互作用的蛋白在肾癌患者中有共同的作用，所有这些研究提示PLK5蛋白与肾脏透明细胞癌的进展及预后密切相关。