乳蛋白呈味肽的酶解工艺优化

李心芯

（江苏旅游职业学院，江苏扬州，225000）

0 引 言

乳品香精凭借其独特的口感，一直广受消费者的青睐。随着生活水平的提高，化学合成的奶味香精已经难以满足消费者对健康和营养的需求，天然奶味香精成为市场的新导向。研究发现，通过酶解乳脂得到的脂肪酸具有奶制品独特的奶香风味，是制备天然奶味香精的有效途径[1]。而国内对分离乳脂后剩余的乳蛋白的应用研究，尤其是呈味方面的研究尚处于起步阶段，目前的报道涉及牡蛎[2]、牛骨[3]、鳕鱼[4]、大豆[5]等。本研究利用蛋白酶将分离乳脂后剩余的乳蛋白进行水解，得到兼具营养和呈味功能的多肽和氨基酸，并对其酶解工艺进行优化，为制取乳味足、滋味好的天然乳品香精提供基础，有较广阔的应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料与试剂

新西兰奶油，食品级，上海爱普香精香料有限公司；中性蛋白酶Neutrase，食品级，诺维信中国投资有限公司，简称N酶；复合风味蛋白酶Flavourzyme，食品级，诺维信中国投资有限公司，简称F酶，其他试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 仪器与设备

HH-2数显恒温水浴锅，XW-80A旋涡混合器，722型分光光度计，90-2型定时恒温磁力搅拌器，GL-20B型冷冻离心机，LGJ－10冷冻干燥机，Delta 320 pH计，自制酶反应器、电子天平等。

1.2 方法

1.2.1 奶油分离蛋白的制备

在50℃下将新西兰奶油融化，离心去除上层乳脂，剩余溶液用LGJ－10冷冻干燥机冷冻干燥后，得到奶油分离蛋白冻干粉，简称奶油分离蛋白。

1.2.2 原料基本成分分析方法

脂肪含量的测定：碱水解法GB5413.3-2016；蛋白的测定：凯氏定氮法GB5009.5-2016；水分的测定：干燥法GB5009.3-2016；灰分的测定：灼烧重量法GB5009.4-2016；乳糖的测定：高效液相色谱法GB5009.8-2016。

1.2.3 蛋白酶的选择

加入pH 7.0磷酸缓冲液，控制底物浓度2.5%，恒温50℃下反应4 h后，对酶解产物的滋味进行感官评价，初步筛选出本实验适用的酶种。

1.2.4 酶解工艺的技术路线

在自制酶反应器中加入适量底物及缓冲液，并将其置入恒温水浴中，固定搅拌速度，设定反应体系初始pH及反应温度，加入酶进行反应，并允许在酶反应过程中pH自然下降[6]。恒温反应一定时间后，85℃灭酶10 min，待反应物冷却后取部分酶解产物测定其总氮含量和12%TCA-N，其余浓缩并冻干后进行感官评定。

1.2.5 蛋白酶解的工艺指标

1.2.5.1 12%三氯乙酸-可溶性氮（12%TCA-N）的测定

方法：移取2.5 mL反应液，加入25 mL质量浓度12%的三氯乙酸（TCA）溶液，用20 mL缓冲液进行充分冲洗，将所得悬浮液离心20 min（4 000 r/min），取一定量上清液移入凯氏消化瓶中，进行凯氏微量定氮。

三氯乙酸是一种常用的蛋白质沉淀剂，所以12%TCA-N中的主要成分是小分子肽以及游离氨基酸。12%TCA-N的高低能反映蛋白酶对底物水解的程度[7]。

1.2.5.2 蛋白酶水解过程中生成肽占总氮的百分含量

肽百分含量：水解过程中生成的肽占总氮的百分含量。其计算公式如下：

TCA-N:肽百分含量；0hTCA-N:酶解反应前反应物中总肽的含量（mg/mL）；12hTCA-N:酶解反应后反应产物中总肽的含量（mg/mL）;总N：反应物中的总氮含量（mg/mL）。

1.2.5.3 感官评价

本实验采用国家标准风味剖面检验法（GB 12313-1990）,对酶解产物的滋味进行感官评价。感官评价小组由13名年龄在21-25岁、经过培训的感官评价员组成，男女分别为6、7人。评分采用5分制（0表示没有，5表示强烈），对酶解产物的滋味（包括奶味、鲜味、酸味和苦味）进行评价。滋味评价首先确定在既定的酶解时间下酶解产物最佳稀释度，本次选取将水解产物冷冻干燥后称取适量，添加入0.025 g/mL的糖水溶液。进行感官评价时样品温度保持在40℃，13名感官评价员根据不同蛋白酶解液的整体滋味进行评价，每一样品的每个特性取评分的均值作为感官评价的结果，然后进行排序。

1.2.6 单因素实验

以奶油分离蛋白作为蛋白酶反应的底物，对其反应条件进行单因素实验，选择TCA-N%为蛋白水解反应水解度参数，对反应的底物浓度、温度和初始pH三个因素进行探索。

1.2.7 酶解产物的感官评定

1.2.7.1 酶解底物的稀释倍数

选择12 h酶解产物，两种酶解产物均按2%、2.5%、3%、3.5%、4%的比例添加到0.025 g/mL的蔗糖水溶液中进行评定。

1.2.7.2 选择酶解产物滋味最佳的水解时间

感官评价员根据对酶解产物的感官评价（酸味、苦味、奶味、鲜味，每项最低1分，最高5分）和喜好程度（最低1分，最高9分）进行评分，分值越高相应滋味的强度越大，计算各项平均分值为最终结果。

1.2.8 响应面实验

根据底物二次筛选的结果，选取适当因素，每个因素选取三个水平，进行响应面实验。

2 结果与讨论

2.1 奶油分离蛋白的主要成分

如表1所示，奶油分离蛋白的主要成分是蛋白质，含量占近四分之三。脂肪含量约为7.5%，这些未彻底分离的脂肪可能是由紧密吸附在脂肪球膜蛋白表面的少量乳脂肪随球膜蛋白一起被分离而引入的[8]。此外，其还含有少量的乳糖、水分和灰分。

表1 底物的主要成分分析结果

2.2 蛋白酶的选择

目前市场上酶制剂种类繁多，但大部分水解过程中易生成苦味物质，因而本研究选用酶解制备香精香料中最常用的F酶和N酶进行研究[9]。N酶作为内切酶，单独使用时水解蛋白的能力较强，易水解过度生成苦味肽，进而影响酶解产物的感官品质[10]。F酶同时具有内切蛋白酶和外切肽酶两种酶活力，能较好的增进和改善食品的风味，但其活力较低，单独使用时总氮回收率不高，为克服其缺点，与N酶联合使用，以达到较高的水解程度并得到良好风味的产品[11]。

结果显示（表2），单独使用N酶，酶解产物有明显的苦味，而单独使用F酶时，酶解产物的滋味显著增强。为了获得更高的产量，联合使用N酶和F酶对乳制品进行酶解，则在滋味增强的同时消除了苦味[12]。

表2 酶解产物感官评定结果

2.3 单因素实验

2.3.1 底物浓度对TCA-N%的影响

选定 4个底物浓度（0.02 g/mL、0.028 g/mL、0.036 g/mL、0.044 g/mL），观察不同的底物浓度对酶解后TCA-N%的影响（图1）。当奶油分离蛋白底物浓度由0.02 g/mL升高到0.028 g/mL时，TCA-N%升高较快，并在底物浓度0.028 g/mL时达到最高值，继续加大底物浓度，TCA-N%并没有随之升高，而是相对稳定。

底物浓度会直接影响酶解过程中蛋白酶的浓度，进而影响反应的进行程度。如果底物浓度偏高，就会导致蛋白酶浓度偏低，不能水解生成足量的滋味物质；反之，则会导致蛋白酶浓度过高，进而使整个酶解过程速度过快不便控制，易生成苦味肽影响酶解产物的滋味。通过图1可以看出，实验最佳底物浓度为0.028 g/mL。

图1 底物浓度对TCA-N%的影响

2.3.2 温度对TCA-N%的影响

选定5个温度水平40、45、50、55、60 ℃，观察不同温度下对酶解产物TCA-N%水平的影响（图2）。当温度从40℃上升到45℃时，奶油分离蛋白的酶解产物TCA-N%呈快速上升趋势，并在45℃时达到最高值，此时随着温度继续升高，酶解产物TCA-N%呈现下降趋势。

温度会影响酶催化反应的反应速度以及酶的稳定性，不同的酶有不同的最适反应温度范围，过高或过低都会对酶解过程产生不利影响。尤其是温度高于55℃以后，水解度明显下降。通过图2可以看出，实验最佳酶解温度为45℃。

图2 温度对TCA-N%的影响

2.3.3 初始pH对TCA-N%的影响

选定五个不同水平（初始pH 5、6、7、8、9），观察不同pH条件下，酶解产物TCA-N%的情况（图3）。奶油分离蛋白的酶解产物其TCA-N%有两个不同的阶段，首先当pH从5升至6时，TCA-N%快速增加，而在pH6升至7的过程中，TCA-N%基本保持稳定，当pH进一步升高，由7到8时，TCA-N%快速增加并达到最大值。当pH由8至9时，酶解产物浓度呈快速下降趋势。

酶解初始pH不仅会影响酶催化反应中酶的稳定性，还会影响酶与底物的结合，以及反应进行的程度，因而pH值过高或过低都不利于酶解反应的进行。从图2-图3可以看出，初始pH对酶解进程的影响要大于其他因素，且在初始pH 8时酶解效果最好,TCA-N%最高，因此本实验选择反应初始pH为8。

2.4 酶解产物的感官评定[13]

图3 初始pH对TCA-N%的影响

根据上述单因素实验的结果，在N酶添加量2%，F酶添加量6%的基础上，选择初始pH 8，反应温度45℃，底物浓度0.028 g/mL，分别取奶油分离蛋白和浓味切达奶酪反应12 h的酶解产物，再按2%、2.5%、3%、3.5%、4%的比例添加到0.025 g/mL的蔗糖水溶液中进行初步的感官评价，选择适宜进行感官评价的酶解产物比例。结果（表3）显示，2%的奶油分离蛋白的酶解产物口味偏淡，但大于3%时口味又过于浓郁；在酶解产物为2.5%时既有明显的滋味，又没有厚重感。因此选择2.5%的酶解产物进行感官评价。

表3 选择产物适合稀释倍数的感官评定结果

为观察奶油分离蛋白经过不同酶解时间后的滋味变化，根据上述感官评价结果，分别取酶解进行8、10、12和14 h的产物，选择2.5%奶油分离蛋白酶解产物添加到0.025 g/mL的蔗糖水溶液中进行全面的感官评价。13名感官评论员对酶解产物的滋味（包括酸味、苦味、奶味和鲜味）进行评分，评分采用5分制（0表示没有，5表示强烈）。评分结果见表4。

表4 选择产物产生最佳牛奶滋味的水解时间的感官评定结果

感官评价结果（表4）显示，奶油分离蛋白12 h的酶解产物奶味和鲜味最高，14 h的酶解产物苦味最高。因此，选择奶油分离蛋白的12 h酶解产物样品做进一步的感官评价。

取奶油分离蛋白12 h的酶解产物的冻干品进行接受性感官评价。由13名感官评论员采用9点快感标度法进行打分(非常喜欢、很喜欢、喜欢、稍喜欢、一般喜欢、稍不喜欢、不喜欢、很不喜欢、非常不喜欢)，取平均分值进行分析，满分为9分，分值越高说明接受度越大。试验结果如表5所示。奶油分离蛋白12 h酶解产物的接受度为6.9，在具体口味描述上，感官评价员认为：奶味足，无苦味，但稍有酸味。

表5 奶油分离蛋白12 h酶解产物冻干品感官评定

2.5 酶解工艺参数的响应面优化

为进一步优化奶油分离蛋白酶解参数，基于上述单因素实验的结果，在底物浓度为0.028 g/mL，加酶量不变的条件下对奶油分离蛋白的水解采用响应面设计的中心组合实验Box-Behnken设计方案[14]。以感官评价（综合奶味0～5分、鲜味0～5分、酸味0～-5分和苦味0～-5分，最高10分，最低0分）为指标，选择能够显著影响酶解产物理化和感官特性的三个因素：酶解时间（A）、初始pH（B）以及酶解温度（C）为参考因素，分别以低、中、高三个水平对自变量进行编码（表6），实验设计方案和实验结果见表7。

表6 Box-Behnken响应面设计实验因素与水平

表7 Box-Behnken实验设计与结果分析

根据试验表实施后，需要对实验数据进行二次回归拟合，然后得到交互项和平方项的二次方程Y=β0+∑βiXi+∑βijXiXj+∑βiiXi2。其中Y是预测响应值，本研究中为感官评价值；X是自变量，本研究中为酶解时间、酶解pH和酶解温度，β为待估计参数值。

采用Design-Expert 7.1.3软件对响应面实验数据进行线性拟合方差分析，考查因素显著性，根据回归方程，响应面曲线、高等线图，分析各个因素交互作用的显著性，其实验结果如下：通过分析表7，各因素与感官评价指标的二次多项式模型方差分析结果见表8。主模型F值为2.87，有显著的统计学差异（p=0.0157）。模型的确定系数值为0.8803，说明方程的因变量与全体自变量间线性关系明显，模型能很好的解释88.0%响应值的变化，该模型拟合度较好。模型的变异系数值为16.0%，说明模型的精密度不是很好，可能是因为感官评价指标主观性较大，而感官评价员人数较少（13人）导致数据的变异较大所致。后续研究中需要用客观指标如12%TCA-N结合感官评价指标进行综合评定。本研究模型的信噪比Adeq Precision的值较高（6.60），即可以利用该回归模型代替实验真实点对酶解产物进行分析和预测。但由于Pred R-Squared值与Adj R-Squared值相差较大，也表明该响应面方程需要做进一步的优化。综上所述，该模型在一定程度上说明各因素水平区间设计比较合理，能够在一定程度上反映酶解产物感官值与酶解时间、酶解pH以及酶解温度之间的关系。

回归模型各项的方差分析结果表明，A2，B2，C2项均为显著项，B项也近似显著。利用旋转实验设计软件得到回归方程如下：

感官评价值=6.12-0.096A+0.57B+0.25C+0.23AB+0.63AC-0.10BC-1.28A2-1.41B2-0.91C2

该方程表达酶解产物的感官评定值与酶解时间、酶解温度和酶解pH因素之间的变化规律。

表8 响应面二次模型方差分析

图4至图6则分别表示了酶解作用时间，酶解初始pH和酶解温度对酶解产物感官评价结果的影响。

利用软件对响应面结果进行最优化分析，确定在底物浓度为0.028 g/mL，N酶的添加量2%，F酶的添加量为6%的前提下，酶解作用时间为12.04 h，初始pH 8.2和酶解温度为45.66℃条件下感官评价结果为6.19。表明该模型可为复合蛋白酶水解乳蛋白生成呈味肽的水解工艺提供指导。

2.6 最佳酶解条件验证试验

由于实验室设备条件限制，设置最佳酶解条件为底物浓度为0.028 g/mL，N酶的添加量2%，F酶的添加量为6%，酶解温度46℃、初始pH8、酶解时间12 h，进行验证试验。

对验证试验中的乳蛋白酶解产物进行感官评价，13名感官评论员采用9点快感标度法，对酶解产物进行打分，结果为7.08±0.76；具体口味描述上，评价员一致认为该奶油分离蛋白的酶解产物奶味足，无苦味，与预测试验结果一致。

图4 45℃时酶解作用时间和酶解pH的交互作用对酶解产物感官评价的影响。

图5 pH8时酶解时间和酶解温度的交互作用对酶解产物感官评价的影响。

3 结 论

图6 酶解时间12 h，酶解温度和酶解pH的交互作用对酶解产物感官评价的影响。

试验首先通过单因素试验研究了底物浓度、酶解温度、酶解初始pH值对酶解产物三氯乙酸-可溶性氮含量（TCA-N%）的影响，确定在N酶的添加量2%，F酶的添加量为6%的条件下，奶油分离蛋白的单因素最佳水解条件为：初始pH 8，温度45℃，底物浓度0.028 g/mL。并以感官评定为指标，进一步通过响应面优化酶解工艺，确定在底物浓度0.028 g/mL，N酶的添加量2%，F酶的添加量为6%的前提下，最佳酶解条件为温度45.66℃，pH 8.2，反应时间12.04 h。此时的酶解产物奶味较足，无苦味。