survivin对血小板源生长因子刺激的人视网膜色素上皮细胞增殖的影响及机制

孟岩 刘宏伟 孙鹏

(佳木斯大学附属第一医院眼科，黑龙江 佳木斯 154002)

眼内出血、孔源性视网膜脱离、眼球穿通伤和视网膜脱离复位手术以后，视网膜表面、玻璃体内的细胞增生及收缩会引起牵引性的视网膜脱离，称为增生性玻璃体视网膜病变，该病的发生与血小板源生长因子(PDGF)有关，其可以促进细胞分裂，诱导视网膜色素上皮细胞增殖，而视网膜色素上皮细胞过度增殖是增生性玻璃体视网膜病变发生的重要原因之一，因此，研究抑制PDGF对视网膜色素上皮细胞增殖诱导作用对于防治相关眼病的发生具有十分重要的意义〔1～3〕。survivin是一种与细胞凋亡有关的调控基因，其是一种凋亡抑制因子，能够促进细胞增殖、抑制细胞凋亡，在生命体正常生理功能维持中具有重要作用〔4,5〕。研究表明，survivin反义核苷酸可以诱导人视网膜色素上皮细胞凋亡，并且在人视网膜色素上皮细胞凋亡中表达下调〔6,7〕。本实验探讨survivin在PDGF处理的人视网膜色素上皮细胞增殖凋亡中的作用。

1 材料与方法

1.1材料 人视网膜色素上皮细胞hRPE购自北京北纳创联生物技术研究院；JC-1染液线粒体膜电位检测试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司；胞质蛋白提取试剂盒购自上海浩然生物技术有限公司；cDNA合成试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；qRT-PCR试剂盒购自美国Thermo Fisher；引物均由金斯瑞生物科技有限公司合成；survivin抗体购自美国Pllaboratories；Lipofectamine2000购自美国Invitrogen；PDGF购自美国R&D；siRNA control和survivin siRNA由上海吉凯基因化学公司合成；剪切型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved Caspase-3)、细胞色素(Cyt)C抗体购自美国CTS。

1.2实验分组 人视网膜色素上皮细胞hRPE培养条件为：37℃，5% CO2培养箱，用含有10%胎牛血清的低糖DMEM培养，培养液中加入100 μg/ml链霉素和100 U/ml青霉素。细胞分为：对照组、PDGF组、siRNA control+PDGF组、survivin siRNA+PDGF组。PDGF组、siRNA control+PDGF组、survivin siRNA+PDGF组细胞培养时在细胞培养液中加入10 μg/L的PDGF，siRNA control+PDGF组、survivin siRNA+PDGF组细胞分别用转染siRNA control和survivin siRNA后的hRPE细胞，对照组细胞不做任何处理。细胞转染的步骤同方法与Lipofectamine 2000转染试剂说明书相同。首先用qRT-PCR和Western印迹方法测定对照组、PDGF组细胞在培养24 h以后，细胞中survivin mRNA和蛋白水平。再以qRT-PCR和Western印迹方法检测PDGF组、siRNA control+PDGF组、survivin siRNA+PDGF组细胞培养24 h后细胞中survivin mRNA和蛋白水平，步骤同1.3和1.4。

1.3qRT-PCR检测人视网膜色素上皮细胞中survivin水平 收集各组细胞，以每107个细胞中加入1 ml的Trizol把各组细胞裂解以后，在裂解液中添加200 μl的三氯甲烷，室温剧烈震荡15 s后，静置10 min。转移到4℃离心机，以10 000 r/min离心10 min。吸取最上层溶液同异丙醇充分混合以后，离心。将上清溶液吸除掉以后，添加75%的乙醇将RNA沉淀洗涤3次。将RNA置于室温中，待乙醇全部挥发以后，以焦碳酸二乙酯(DEPC)处理后的水溶解。移液枪吸取约2 μl的RNA以紫外分光光度计检测浓度和纯度。取2 μg的RNA，按照逆转录试剂盒合成cDNA后，进行qRT-PCR，PCR为25 μl反应体系，其中包括：cDNA 1 μl、1 μl的10 μmol/L引物、12.5 μl的2×SYBR Green混合物。PCR仪设置程序为：95℃ 30 s，(62℃ 30 s，72℃ 1 min，共40个循环)。β-actin为内参基因，引物为：β-actin-正义链5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′，反义链5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′。survivin-正义链5′-GGAC-CACCGCATCTCTACAT-3′，反义链5′-GCAC-TTTGCCAGTTTCC-3′。

1.4Western印迹检测人视网膜色素上皮细胞中survivin水平 收集各组细胞，在细胞中加入蛋白裂解液，以常规方法提取各组细胞蛋白，并以二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度。蛋白样品在-80℃保存。每个泳道上样40 μg，在上样前将蛋白同上样缓冲液煮沸变性后，加入到上样孔内，凝胶为：10%的分离胶、5%的浓缩胶。在浓缩胶中电泳电压为80 V，在分离胶中电泳电压为100 V。观察溴酚蓝达到凝胶的底部边缘以后，把电源关闭，终止电泳。取出凝胶，将凝胶上的蛋白转移到裁剪好的聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，转膜置于冰上进行，转膜的电压调整为90 V。转膜结束后的PVDF膜用5%牛血清白蛋白置于37℃中封闭2 h以后，再放入含有一抗(1∶400稀释，4℃过夜)、二抗(1∶2 000稀释，37℃孵育2 h)的孵育袋中充分结合，用电化学发光(ECL)法化学放光以后，用Bio-Rad采集各组图像，用Quantity One分析条带的灰度值，β-actin作为内参，用各目的条带的灰度值与β-actin灰度值的比值表示目的蛋白水平。

1.5噻唑蓝(MTT)检测人视网膜色素上皮细胞增殖情况 人视网膜色素上皮细胞种植到96孔板内，按照对照组、PDGF组、siRNA control+PDGF组、survivin siRNA+PDGF组方法分组处理，分别在培养24 h、48 h、72 h后，在每个培养板的孔内加入MTT溶液，孵育4 h以后，把上清溶液吸弃掉，添加二甲基亚砜(DMSO)，待结晶物溶解掉以后，将96孔板置于酶标仪上，调整波长为492 nm，测定OD值。

1.6流式细胞术检测人视网膜色素上皮细胞凋亡情况 各组按照上述方法孵育48 h以后，以磷酸盐缓冲液(PBS)把各组视网膜色素上皮细胞洗涤2次，在细胞中加入400 μl的结合缓冲液，再分别加入5 μl的膜联蛋白(Annexin)V-FITC和碘化丙啶(PI)，于室温中孵育15 min以后，在60 min内以流式细胞仪检测。各组按照上述方法孵育48 h以后，提取细胞总蛋白，用Western印迹方法测定细胞内Cleaved Caspase-3蛋白水平，步骤同1.4。

1.7JC-1法检测线粒体膜电位 各组按照上述方法孵育48 h以后，收集细胞，在细胞中加入JC-1染液，置于37℃孵育30 min，以流式细胞仪检测荧光强度，荧光强度越高，线粒体膜电位越高。

1.8Western印迹检测胞质中CytC蛋白水平 各组按照上述方法孵育48 h以后，用胞质蛋白提取试剂盒提取胞质中的蛋白，以Western印迹方法测定CytC蛋白水平。步骤同1.4。

1.9统计学分析 采用SPSS21.0软件进行独立样本t检验、单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1PDGF处理后视网膜色素上皮细胞中survivin表达水平 PDGF组survivin mRNA和survivin 蛋白水平均显著高于对照组(P<0.05)。见图1、表1。

图1 Western印迹测定survivin蛋白表达

组别survivin mRNAsurvivin 蛋白对照组1.00±0.000.14±0.04PDGF组3.62±0.250.46±0.03t/P值18.152/0.00011.085/0.000

2.2各组细胞中survivin表达水平 survivin siRNA+PDGF组survivin mRNA和蛋白水平显著低于PDGF组(P<0.05)。siRNA control+PDGF组survivin mRNA和蛋白水平与PDGF组比较差异没有统计学意义(P>0.05)。见图2、表2。

1～3：PDGF组、siRNA control+PDGF组、survivin siRNA+PDGF组图2 Western印迹测定survivin蛋白表达

组别survivin mRNAsurvivin 蛋白PDGF组1.00±0.000.51±0.06siRNA control+PDGF组1.01±0.130.50±0.08survivin siRNA+PDGF组0.23±0.041)0.17±0.051)F/P值97.411/0.00026.952/0.001

与PDGF组比较：1)P<0.05

2.3各组视网膜色素上皮细胞增殖能力比较 PDGF组视网膜色素上皮细胞OD值明显高于对照组(P<0.05)。survivin siRNA+PDGF组视网膜色素上皮细胞OD值显著低于PDGF组(P<0.05)。siRNA control+PDGF组视网膜色素上皮细胞OD值与PDGF组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

2.4各组视网膜色素上皮细胞凋亡率比较 PDGF组细胞凋亡率及Cleaved Caspase-3蛋白水平明显低于对照组(P<0.05)。survivin siRNA+PDGF组细胞凋亡率及Cleaved Caspase-3蛋白水平显著高于PDGF组(P<0.05)。siRNA control+PDGF组细胞凋亡率及Cleaved Caspase-3蛋白水平与PDGF组差异无统计学意义(P>0.05)。见图3、图4、表4。

2.5各组线粒体膜电位及CytC水平比较 PDGF组线粒体膜电位显著升高，CytC水平显著降低，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。survivin siRNA+PDGF组线粒体膜电位显著降低，CytC水平显著升高，与PDGF组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。siRNA control+PDGF组线粒体膜电位及CytC蛋白水平与PDGF组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图5、表5。

表3 各组视网膜色素上皮细胞OD值比较

与对照组比较：1)P<0.05；与PDGF组比较：2)P<0.05；表4、5同

1～4:对照组;PDGF组;siRNA control+PDGF组;survivin siRNA+PDGF组；图5同图3 Western印迹检测细胞中Cleaved Caspase-3蛋白水平

图4 各组流式细胞术检测结果

表4 各组细胞凋亡率及Cleaved Caspase-3蛋白水平比较

图5 Western印迹检测细胞质中CytC蛋白水平

组别线粒体膜电位(荧光值)CytC对照组645.26±34.230.38±0.04PDGF组892.45±31.301)0.14±0.031)siRNA control+PDGF组897.62±21.930.15±0.04survivin siRNA+PDGF组715.46±26.282)0.26±0.042)F/P值58.457/0.00026.579/0.000

3 讨 论

PDGF能够刺激胶质细胞、成纤维细胞、血管平滑肌细胞等多种细胞增生，是一种较强的分裂诱导剂，在单核巨噬细胞、平滑肌细胞、内皮细胞、血小板等中存在，不仅参与组织的生长和发育，还与创伤的愈合、肿瘤等有关〔8～12〕。研究表明，PDGF参与眼科疾病的发生，其可以诱导角膜成纤维细胞增殖、抑制晶状体上皮细胞生长，可以在体外诱导人视网膜色素上皮细胞增生〔13～15〕。本实验结果表明，PDGF刺激后的视网膜色素上皮细胞增殖能力升高，说明PDGF诱导视网膜色素上皮细胞增生，与上述研究报道结果一致。

survivin基因位于染色体17q25上，其编码的蛋白质含杆状病毒凋亡抑制蛋白重复序列，在这个序列中包括一个Cys-Pro-Thr片段，这个片段将该序列分成两个部分，在survivin的羧基端有一个α-螺旋motif，参与微管结合过程，这些功能结构域与survivin蛋白的功能密切相关〔16〕。survivin与细胞的生长和凋亡有关，其可以通过Caspase途径诱导细胞凋亡的发生〔17〕。在心肌细胞、肿瘤细胞、关节炎细胞等多种细胞中已经证实survivin参与调控细胞的增殖和凋亡〔18〕。survivin在增生性玻璃体视网膜病变中表达阳性，参与视网膜色素上皮细胞增殖，下调其表达后可以诱导细胞凋亡，促进细胞增殖〔19〕。本实验结果显示，PDGF刺激后的视网膜色素上皮细胞中survivin水平升高，提示survivin可能参与增生性玻璃体视网膜病变发生。

本实验还通过siRNA技术下调视网膜色素上皮细胞中survivin表达水平，结果发现，survivin沉默后的细胞增殖能力降低，细胞凋亡增多，细胞中Cleaved Caspase-3水平升高，同时线粒体膜电位下降，细胞质中CytC蛋白水平升高，说明下调survivin可以通过线粒体途径诱导PDGF条件下视网膜色素上皮细胞凋亡，抑制细胞增殖。视网膜色素上皮细胞增生与细胞凋亡异常减少有关，其在PDGF处理后，细胞的增殖速度加快，凋亡减少〔20〕。研究显示，survivin不仅参与细胞生长过程，还与细胞凋亡有关，沉默其表达后可以诱导肿瘤细胞、视网膜色素上皮细胞凋亡，其作用机制与细胞内Caspase蛋白家族有关〔21,22〕。线粒体途径是细胞凋亡发生的原因之一，正常情况下，线粒体膜电位在线粒体内外物质交换、渗透压维持中具有重要作用，而在细胞凋亡发生时，线粒体膜电位下降，使得线粒体内的CytC释放至胞质中，而CytC可以激活胞质中的Caspase级联反应诱导细胞凋亡发生〔23～25〕。本实验证实了沉默survivin可以促进PDGF条件下的视网膜色素上皮细胞凋亡，并且其诱导细胞凋亡机制与线粒体途径有关。

综上，PDGF诱导视网膜色素上皮细胞增殖，抑制细胞凋亡，诱导细胞中survivin表达，沉默其表达后可以通过线粒体途径诱导细胞凋亡发生，抑制细胞的增殖，这为以后研究增生性玻璃体视网膜病变过程中视网膜色素上皮细胞增生的机制奠定了基础，对于明确增生性玻璃体视网膜病变发生机制具有重要意义。