气流吹扫-微注射器萃取-气相色谱/质谱法同时快速检测香烟中香豆素和黄樟素

赵锦花， 崔龙吉， 金玉善， 李光雄， 池敬姬， 李 锋， 李河霖， 李东浩*

(1.延边大学理学院化学系，长白山生物资源与功能分子教育部重点实验室，吉林延吉 133002; 2.吉林烟草工业有限责任公司技术中心，吉林延吉 133000)

香豆素化学名称为1，2-苯并吡喃酮，它是一种有芳香气味的芳香族内酯类化合物，在芸香科和伞形科植物中存在较多，其次是在兰科、豆科、菊科、茄科等植物中分布较为广泛[1]。香豆素通常被作为香料，用作定香剂配制香水香料，也用作于香烟、食品中的增香剂。黄樟素是许多食用天然精油，如黄樟精油、八角精油和樟脑油的主要成分[2]，天然存在于沉水樟、坚叶樟等樟属植物精油中[3]。香豆素在动物体内能引起肝脏毒性，自1954年起美国禁止将香豆素用于食品添加剂[4]。近期研究表明，黄樟素能在肝脏组织中形成黄樟素-脱氧核糖核酸加合物，易诱发基因突变和肝脏损伤，是消化系统、泌尿系统、血液系统的强致癌物质[5]。我国在2005年开始实施的《易致毒化学品管理条例》中将黄樟素列为第一类易致毒化学品[6]。香精香料起到改善卷烟的刺激性、掩盖杂气、提高卷烟感官品质的作用[8]，而在添加香精香料过程中，香豆素和黄樟素[7]都会带入到香烟中。

目前，香豆素和黄樟素的样品前处理方法有超声萃取[9]、微波辅助萃取[10]、顶空固相微萃取[11]、分散液液微萃取[12]，而检测方法有气相色谱-质谱法[13 - 16]和高效液相色谱-紫外法[8,17 - 19]等。气流吹扫-微注射器萃取(GP-MSE)样品前处理技术是基于液相微萃取技术发展起来的一种新型的半开放式液相微萃取技术，其基本原理如下：将惰性气体引入到样品基质表面，使惰性气体与气相中目标物混合，带动目标物不断的向萃取溶剂运动，目标物被萃取溶剂吸附，惰性气体流出萃取体系，该过程被不断重复，直到萃取结束。GP-MSE是集样品萃取、净化、浓缩为一体的液相微萃取技术，已广泛应用于大气污染物检测[19]、食品中农药残留检测[20]、石油成分检测[21]等领域。该技术能快速同时萃取挥发性和半挥发性成分，解决了液相微萃取技术富集率低、萃取范围窄、液滴不稳定而重现性差等问题[22]。本研究利用GP-MSE样品前处理技术与气相色谱-质谱(GC/MS)联用技术，快速、准确分析了卷烟产品中的香豆素和黄樟素的含量。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

2010 Ultra型GC/MS仪(日本，岛津公司)；AS20500AH型超声波清洗器(天津AU-TO-SCIENCE公司)；XPE105电子天平(瑞士，梅特勒-托利多公司)；FW-100高速万能粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司)；GP-MSE微萃取仪(延吉艾迪扼科技有限公司)。

香豆素标准品(纯度≥99.0%)购买自德国Dr.Ehrenstorfer)；黄樟素标准品(纯度≥99.0%)购买自美国AccuStandard)。标准储备溶液：准确称取0.0500 g香豆素和0.0500 g黄樟素标准品，置于100 mL容量瓶中，用甲醇稀释定容至刻度并摇匀，得到500.0 mg·L-1混合标准溶液。然后用甲醇再稀释至浓度为5 mg·L-1工作溶液，置于冰箱冷藏储存。甲醇、正己烷、二氯甲烷、丙酮均为色谱纯；0.45 μm有机膜(美国PALL)；玻璃棉(400 ℃下活化10 h)。

1.2 样品制备

1.2.1超声萃取准确称取5.000 g香烟样品，加入5个不同含量的标准物质，制备系列加标样品。用15 mL正己烷超声萃取，每次10 min，共3次。将3次萃取液合并后0.45 μm有机膜过滤，用吹氮仪浓缩，定容至500 μL，待GP-MSE微萃取仪再处理。

1.2.2GP-MSE取上述萃取液20 μL，加载到GP-MSE萃取仪样品槽中，在萃取温度为160 ℃，萃取时间为4 min，气体流速为2 mL·min-1，冷凝温度为-4 ℃的条件下进行萃取，萃取溶剂为正己烷。萃取结束后，加入10 mg·L-1d10-Phe 10 μL仪器内标，定容至100 μL，取2 μL进行GC/MS分析。

1.3 GC/MS 分析条件

色谱柱为DB-5 MS石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；载气为氦气(纯度≥99.999%)，流速为0.98 mL·min-1。色谱柱升温程序如下：初始温度为100 ℃，保持3 min，以6 ℃·min-1升高至180 ℃，再以20 ℃·min-1升高至280 ℃，保持5 min。进样口温度为280 ℃，离子源温度为200 ℃。利用全扫描模式确认保留时间和离子分布及特征离子，实际样品分析时采用了选择离子监测模式。选择的特征离子分别是香豆素为m/z89、90、118、146；黄樟素为m/z104、131、135、162。以m/z118和m/z162分别为两个目标物的定量离子。

2 结果与讨论

2.1 萃取溶剂选择

烟叶的主要化学成分是纤维素(11%)、半纤维素(20%)、果胶(12%)、蛋白质(5%～15%)、尼古丁(1.5%～30%)以及有机酸(12%～16%)等[22]。其中，尼古丁和有机酸对烟叶中黄樟素和香豆素的GC/MS检测干扰大。萃取溶剂的选择直接影响被分析物的萃取效率和共提取物的基质效应。为了消除这些干扰物的影响，选择正己烷、二氯甲烷和丙酮等不同极性溶剂，考察了不同萃取溶剂对黄樟素和香豆素萃取率以及对尼古丁的消除率。通过萃取溶剂优化实验发现，尼古丁的消除率随着萃取溶剂的极性递减而增大，即当正己烷作为萃取溶剂时尼古丁的影响最小，并且不影响黄樟素和香豆素的定性定量，故萃取溶剂选为正己烷。

2.2 萃取温度的优化

在GP-MSE过程中解析温度是影响萃取效率的主参数[23]。选择140、160、180、220、260和300 ℃等不同温度，进行了解析温度对萃取率的影响研究。玻璃棉作为空白基质，加入1 mg·L-1香豆素和黄樟素的混标10 mL进行实验。实验结果如图1所示，除了140 ℃条件之外，在160和300 ℃萃取温度范围内的萃取率均满足分析要求，回收率分别是87%～99%和86%～98%，RSD均小于11.4%，最终选择了160 ℃为最佳萃取温度。

2.3 萃取时间的优化

参照文献报道[24]，对上述样品，分别选择3、4、5 min的萃取时间进行了优化，结果表明在一定的萃取时间范围内，萃取时间对萃取率的影响不大，香豆素和黄樟素的回收率为96%～118%和100%～112%，RSD值小于15%。上述萃取时间均满足分析要求，最终选择4 min为最佳萃取时间，见图2。

图1 萃取温度对香豆素和黄樟素萃取效率的影响Fig.1 Effect of extraction temperature on the extraction efficiency of coumarin and safrole

图2 萃取时间对香豆素和黄樟素萃取效率的影响Fig.2 Effect of extraction time on the extraction efficiency of coumarin and safrole

2.4 加标回收率

图3 不同加标量对香豆素和黄樟素萃取效率的影响Fig.3 Effect of spiked amount on the extraction efficiency of coumarin and safrole

因烟叶基质复杂，尤其是尼古丁含量比较多，严重影响烟叶中挥发性和半挥发性物质的检测。为了考察香烟基质对检测香豆素和黄樟素的影响，进行了基质加标实验。在香烟基质中分别添加1.0、5.0、50.0、500.0 ng的香豆素和黄樟素，考察了加标回收率，见图3。结果显示，在上述浓度区间内，香豆素和黄樟素的回收率分别是80%～87%和83%～97%，RSD值均小于10.6%。

2.5 方法评价

2.5.1线性关系本研究使用外标法对香烟中香豆素和黄樟素的含量进行定量分析。分别取0.05、0.10、0.50、5.00、20.00、30.00和50.00 mg·L-1的香豆素和黄樟素混合标准系列溶液2.0 μL，进行GC/MS分析，以相应的色谱峰强度和浓度分别作为纵坐标和横坐标绘制标准曲线。如图5所示，香豆素和黄樟素标准曲线的R2分别为0.9998和0.9993。

图4 香豆素和黄樟素的标准曲线Fig.4 Calibration curve of coumarin(a) and safrole(b)

2.5.2检出限方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ)分别按3倍信噪比和10倍信噪比计算而获得。香豆素的LOD为0.021 μg·g-1，LOQ为0.07 μg·g-1；黄樟素的LOD和LOQ分别为0.015、0.05 μg·g-1。

2.6 实际样品检测

购买市场上普遍销售的10个品牌香烟样品，分别编为样品1#～10#,检测了其中香豆素和黄樟素的含量。具体含量如表1。在大部分样品中没有检测到黄樟素，而香豆素的检出量为0～230 ng·g-1。

表1 香烟中检测到的黄樟素和香豆素的含量(μg·g-1)

ND：not detected.

3 结论

本研究建立了香烟中香豆素和黄樟素的气流吹扫-微注射器萃取-气相色谱/质谱联用检测方法，香豆素和黄樟素的加标回收率分别为80%～87%、83%～97%，RSD均值小于10.6%，检出限分别为0.021、0.015 mg·g-1,定量限分别为0.07、0.05 mg·g-1。利用本方法成功检测了香烟中的黄樟素和香豆素含量，样品中未检测到黄樟素，香豆素的检出量为0～230 ng·g-1。此方法具有快速、准确、经济、绿色及简便等优点，在烟卷产品的质量控制领域具有良好应用前景。