HOXB9在乳腺癌中的表达及其对预后的意义

朱梦柳,潘婷婷,马小鹏,邓福生

(安徽医科大学附属省立医院普外科，合肥 230001)

尽管乳腺癌患者的治疗和总体预后已经得到了改善，但乳腺癌仍然是全世界女性最常见的癌症之一[1]。其临床病理因素如肿瘤大小、腋窝情况、淋巴结转移情况、病理分级和激素受体水平是乳腺癌治疗的主要影响因素[2]。近年来，多项研究报道HOXB9与多种恶性肿瘤的增殖、迁移和侵袭能力密切相关，如前列腺癌[3-4]、膀胱癌和甲状腺癌[5-7]、结肠癌[8]、肺癌[9]、卵巢癌[10]等。然而，HOXB9在乳腺癌患者中的预后价值及其生物学功能尚不清楚。基于该领域研究的不足，本研究首次通过检测HOXB9 在乳腺癌组织中的表达，分析其表达水平与乳腺癌临床病理特征和预后的关系，探讨其在乳腺癌中的潜在临床价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2009年1月至2013年12月在本院乳腺外科行乳腺癌手术的133例乳腺癌石蜡标本进行免疫组织化学实验。通过Western blot方法检测20例乳腺改良根治术切除的新鲜乳腺癌组织及其对应的癌旁组织(离肿瘤边缘2 cm)中HOXB9蛋白的表达水平。收集每位患者的临床病理数据,例如,年龄、雌激素受体(ER)表达水平、孕激素受体(PR)表达水平、人类表皮生长因子受体(HER2)表达水平、增殖细胞核抗原(ki-67)表达水平、肿瘤大小、淋巴结转移情况、分子分型(Luminal-A、Luminal-B、HER2过表达、三阴型)等相关资料。本研究得到了每位患者的知情同意，并得到了本院临床实验室伦理委员会的批准。

1.2方法

1.2.1免疫组织化学 采用免疫组织化学染色SP法检测人乳腺癌术后标本中乳腺癌组织及其对应的癌旁组织HOXB9的表达部位及强度。操作步骤：4 μm切片，60 ℃烤片过夜；常规脱蜡水化，水洗；高温、高压修复5 min；滴加一抗4 ℃过夜；滴加二抗；滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液37 ℃孵育20 min；二氨基联苯胺(DAB)显色；苏木素复染；显微镜观察；图像分析。HOXB9表达的免疫反应性由本院的2名病理学专家独立评估。免疫组织化学一抗为美国Molecular Tag公司原装进口；多聚赖氨酸、二抗试剂盒及DAB显色试剂盒购自镇江厚普生物科技有限公司。

1.2.2Western blot 在术后新鲜肿瘤组织和对应的癌旁组织进行取材，将组织剪碎，使用细胞裂解液提取蛋白。用蛋白质定量试剂盒(BCA)法进行蛋白水平测定。取75～100 μg蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，后转移至硝基纤维素滤膜，50 g/L脱脂奶37 ℃封闭1 h，加入一抗(兔抗人HOXB9多克隆抗体、鼠抗人β-actin单克隆抗体均购自Santa Cruz Biotechonology公司)，于4 ℃孵育过夜；加入二抗常温孵育1 h，在凝胶成像仪内曝光成像，以β-actin为内参照。

1.2.3结果判定 ER和PR在肿瘤细胞中表达大于或等于1%记为阳性[11]。免疫组织化学中HER2染色大于75%，评分记3+，判断为强阳性；HER2染色25%～75%，评分记2+，需采用FISH法进一步检测HER2阳性；HER2有染色且小于25%，评分记1+；HER2无染色，评分记0，0及1+视为阴性[12]。ki-67>14%为高表达，Ki-67≤14%为低表达[13-14]。乳腺癌的分子亚型分类如下：Luminal-A型(ER和PR阳性，HER2阴性，ki-67低表达)；Luminal-B型(ER和/或PR阳性，且至少有以下1种：(1)HER2阴性，Ki-67高表达；(2)HER2阳性；HER2过表达型(ER和PR阴性，HER2阳性)；三阴型(ER，PR和HER2阴性)[15]。HOXB9的表达用以下公式计算：免疫组织化学得分=标记强度得分×阳性细胞百分比得分[14]。染色强度得分可分为0分(-)、1分(+)、2分(++)、3分(+++)。阳性细胞百分比得分描述为0分(无染色)，1分(<25%)，2分(25%～<50%)，3分(50%～<75%)和4分(≥75%)。免疫组织化学得分大于或等于6分为高表达，<6分为低表达。

1.3统计学处理 采用SPSS16.0软件和Graph Prism6.0软件分析数据。HOXB9蛋白表达与临床病理特征的关系采用非参数检验，两组间比较用Mann-WhitneyU检验，多组之间用Kruskal-Wallis检验；生存分析采用Kaplan-Meier法,差异行Log-rank检验;多因素分析用Cox比例风险模型。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1HOXB9在乳腺癌组织中高表达 133例乳腺癌免疫组织化学结果和临床病理特征分析显示,乳腺癌组织中有70例(52.6%)高表达HOXB9，癌旁组织中有56例(42.1%)高表达HOXB9,差异有统计学意义(χ2=19.8，P<0.01)。HOXB9在乳腺癌组织和癌旁组织的细胞核中高表达，见图1。Western blot表明在20个新鲜乳腺癌组织中有18个高表达(90.0%)。HOXB9在乳腺癌和癌旁组织中表达水平分别为1.10±0.04，0.70±0.10，差异有统计学意义(P<0.01)，见图2。

A：HOXB9在乳腺癌组织中的高表达；B：HOXB9在癌旁组织中低表达

图1 HOXB9在乳腺癌及癌旁组织中的免疫组织化学结果(×400)

A:Western blot;B:HOXB9蛋白水平的统计分析;T:乳腺癌；N:癌旁组织

图2 HOXB9在20对乳腺癌及癌旁组织表达的Western blot结果

2.2乳腺癌临床病理资料与HOXB9表达的关系 研究结果表明,高表达的HOXB9与乳腺癌组织中ER表达水平、HER2表达水平、ki-67表达水平、淋巴结转移、复发率、Luminal-B型密切相关,差异有统计学意义(P=0.030，P<0.01，P<0.01，P=0.016，P<0.01，P<0.01)。然而,HOXB9表达水平与年龄、肿瘤大小、Luminal-A型、HER2-过表达、三阴型乳腺癌无明显相关性，差异无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

表1 HOXB9的表达与乳腺癌患者临床病理参数的关系(n,n=133)

续表1 HOXB9的表达与乳腺癌患者临床病理参数的关系(n,n=133)

2.3HOXB9表达乳腺癌患者预后的关系 随访并记录乳腺癌患者的生存期，随访时间为20～96个月，中位随访时间66个月。采用Kaplan-Meier法进行生存分析，结果显示HOXB9高表达患者总生存期(OS)较HOXB9低表达患者短[(58.0±2.5)个月vs.(68.8±1.5)个月]，P<0.01,见图3A。在Luminal-B型、Her2过表达型及三阴型患者中，HOXB9高表达患者OS较HOXB9低表达患者短，差异有统计学意义[(52.4±3.0)个月vs.(62.7±2.7)个月,P<0.01;(60.4±5.2)个月vs.(68.8±2.5)个月,P=0.008;(58.5±5.8)个月vs.(72.3±2.6)个月,P=0.041]，见图3C～E。而Luminal-A型患者中，HOXB9高表达患者OS与HOXB9低表达患者差异无统计学意义[(76.0±6.3)个月vs.(73.5±3.9)个月,P=0.251],见图3B。此外,单因素分析表明，HOXB9表达(P<0.01)，淋巴结转移(P<0.01)，ki-67表达(P<0.01)，Luminal-B型(P=0.001)与乳腺癌患者的OS显著相关，见表2。在Luminal-B型乳腺癌患者中，HOXB9表达(P<0.01)、淋巴结转移(P=0.033)、ki-67表达(P=0.001)与OS显著相关；在HER2过表达型乳腺癌患者中，HOXB9表达(P=0.016)、淋巴结转移(P=0.044)、ki-67表达(P=0.04)与OS显著相关；三阴型乳腺癌患者中，HOXB9表达(P=0.05)、淋巴结结转移(P=0.002)、ki-67表达(P=0.004)与OS显著相关；在Luminal-A型乳腺癌患者中无相关因素与OS相关，见表2。多因素分析表明，乳腺癌患者中HOXB9表达(P<0.01)、淋巴结转移(P=0.001)、ki-67表达(P<0.01)是OS的独立影响因素。在Luminal-B型乳腺癌患者中，HOXB9表达(P=0.013)、淋巴结转移乳腺癌(P=0.02)是OS的独立影响因素。在HER2过表达型腺癌患者中，HOXB9表达(P=0.026)、ki-67表达(P=0.002)是OS的独立影响因素。在三阴型乳腺癌患者中，HOXB9表达(P=0.037)、淋巴结转移(P=0.003)是OS的独立影响因素。在Luminal-A型患者中，无因素与OS相关，见表2。

图3 不同HOXB9表达的乳腺癌患者OS曲线

表2 影响乳腺癌患者OS的单因素、多因素分析(n=133)

续表2 影响乳腺癌患者OS的单因素、多因素分析(n=133)

淋巴结转移中，<4个记为+，≥4个记为-

3 讨 论

乳腺癌的复发和远处转移已经成为乳腺癌患者死亡的主要原因[15]。乳腺癌作为一种异质性疾病，具有许多独特的生物学特征。不同分子分型(Luminal-A、Luminal-B、Her2过表达型和三阴型)的预后和治疗策略不同。然而，很少有研究探讨HOXB9在乳腺癌不同分子分型中的预后价值。因此，本研究不仅分析了整体的乳腺癌患者的预后，也分析了不同分子分型的乳腺癌患者的预后。

同源异型盒(HOX)基因的异常表达常发生在肿瘤组织中[5]。已有多项研究表明，HOX基因在胚胎发生过程中会产生复杂的作用，或许HOX基因在癌细胞中的异常表达与其促进肿瘤细胞生长有关，例如促进其侵袭性、迁移性和增殖活性。有研究表明，HOXB9在胃癌中高表达，HOXB9可能是胃癌患者预后不佳的一个新标志[16]。也有研究表明，HOXB9的过表达与白血病、小儿急性髓系白血病(AML)[17]、肺癌[9]、脑胶质瘤[18]的进展和转移有关。根据以往的研究可发现HOXB9在不同的肿瘤中扮演着不同的角色。然而，HOXB9在乳腺癌中的表达和临床重要性尚不清楚。

本研究通过免疫组织化学实验观察到HOXB9在乳腺癌中的表达明显高于相应的癌旁组织。高表达的HOXB9在乳腺癌患者中与其临床特征显著相关，包括ER表达水平、HER2表达水平、ki-67表达水平、淋巴结转移、复发率、Luminal-B型。此外，Western blot结果显示，HOXB9在乳腺癌组织中的高表达，与免疫组织化学结果一致。笔者猜测HOXB9在乳腺癌中的高表达可能与启动子区域的甲基化有关。然而，其全面真实机制需要进一步调查。综上所述，HOXB9在乳腺癌中的高表达可能与乳腺癌的发生、侵袭性及肿瘤分化有关。

与Luminal-B、Her2过表达和三阴型患者相比，Luminal-A型患者HOXB9高表达与OS无明显相关系。这可能与该研究中Luminal-A型患者数量较少有关。此外，Cox风险评估提示HOXB9是乳腺癌术后独立预后因素，但本研究未能阐明HOXB9的分子机制。笔者推测HOXB9是通过调控乳腺癌内质网应激反应发挥癌基因作用，其具体的分子机制需要进一步研究。

本研究表明HOXB9在乳腺癌中的表达具有组织特异性，但它并不是直接使乳腺上皮细胞恶变[18]。HOXB9在乳腺癌中的异常表达可能会促进肿瘤的进展，而不是肿瘤发生。然而，现有的研究还不足以在HOXB9和它们所导致的癌症之间建立精确的因果联系，也不足以明确HOXB9基因是如何影响肿瘤的组织特异性。

综上所述，本研究发现HOXB9在乳腺癌中高表达，其表达与乳腺癌患者临床特征、OS有关。HOXB9可能在乳腺癌的早期诊断和预后预测中起着重要作用，在临床研究中也是必不可少的。然而，HOXB9促进乳腺癌进展的分子机制尚不清楚，需要进一步研究。