靶向纳米探针在结直肠癌干细胞荧光成像及光热治疗中的研究

曹 永，吕 强，孙迎燕，高晓虹

(1.遵义医学院法医病理教研室,贵州遵义 563099；2.牡丹江医学院医药研究中心，黑龙江牡丹江 157011；3.牡丹江医学院红旗医院超声科，黑龙江牡丹江 157011；4.牡丹江医学院生物技术实验室，黑龙江牡丹江 157011)

肿瘤干细胞(cancer stem cell,CSC)概念是MACKILLOP等[1]于1983年提出,认为CSC是维持肿瘤生长的核心，是肿瘤发生侵袭转移的根源。LAPIDOT等[2]于1994年将急性髓性白血病中CD34+CD38-的瘤细胞接种到非肥胖糖尿病/重症联合免疫(NOD/SCID)小鼠体内时能形成肿瘤，进而证实CSC的存在。随后，证实CSC是肿瘤组织内具有自我更新和异体种植成瘤能力的一小群细胞[3-4]，如在乳腺癌、结肠癌等中均分离出CSC[2-4]。众多学者认为肿瘤侵袭由少数具有特殊表型的细胞做诱发，这些细胞具有与CSC相似的特性[5-6]。目前，诸多研究已证实CD44可以参与细胞间的信号传导，并与肿瘤的生长、侵袭、转移及造血干细胞的归巢等密切相关。在胃癌、结肠癌、肝癌等中普遍存在CD44v6表达失控，CD44v6高表达与肿瘤进展、转移及预后等过程有关[7]。然而，关于CD44在结直肠癌侵袭转移中的作用仍未明确。而上转换纳米粒子(up-conversion nanoparticles,UCNPs)具有生物安全性高、抗光漂白作用强、发光稳定性好，且易与抗体相耦联等优点。因此，本实验拟构建CD44v6功能化UCNPs探针，并将其应用于体外结直肠癌CSC的荧光成像及光热治疗，为结直肠癌的早期诊断及治疗提供一定理论基础。

1 材料与方法

1.1试剂与仪器 六水硝酸钇[Y(NO3)3·6H2O]、六水硝酸镱[Yb(NO3)3·6H2O]、六水硝酸铒[Er(NO3)3·6H2O]、六水硝酸铥[Tm(NO3)3·6H2O]等(上海莎博化工科技有限公司)，氟化钠(NaF)、环己烷(C6H12)等(北京化学试剂公司)，1-乙基-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)、2-无水吗啉乙磺酸(MES)等(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，CD44v6[NO:MCA1730，安诺伦(北京)生物科技有限公司]，透射电子显微镜JEM-1010(日本电子公司JEOL)，傅立叶红外光谱分析仪Tensor 37(德国Bruker Optics公司)，980 nm激光器STL980AIO3-20.0W(北京思通博远激光科技有限公司)，倒置相差显微镜TS100(日本Nikon公司)，小动物活体成像系统Berthold LB983 NC100(德国Berthold Technologies公司)等。

1.2实验方法

1.2.1UCNPs制备 制备UCNPs时参考热解法合成[8],对实验步骤修正改进。

1.2.1.1铒镱共掺杂四氟钇钠(NaYF4:Yb,Er)制备 称取0.012 7 g氧化铒(Er2O3)、0.118 0 g氧化镱(Yb2O3)和0.300 5 g氧化钇(Y2O3)，滴入稀盐酸加热至溶解，结晶后待用。将去离子水、无水乙醇和油酸各10 mL加入烧瓶中，磁力搅拌10 min，将0.394 3 g氧化铵(NH4F)和0.106 4 g氢氧化钠(NaOH)加入烧瓶搅拌10 min；将混合物移到反应釜，180 ℃持续720 min后冷却至室温，将反应物经4 000 r/min,离心20 min，乙醇洗涤3次，70 ℃烘干备用。

1.2.1.2铥镱共掺杂四氟钇钠(NaYF4:Yb,Tm)制备 将NaYF4:Yb,Er制备中的Er2O3用Tm2O3替代，其余方法步骤同1.2.1，即得NaYF4:Yb,Tm。

1.2.2NaYF4:Yb,Er/Tm的表面修饰 配置Lemieux-von Rudloff氧化剂[去离子水30 mL、偏高碘酸钠(NaIO4)2.6 g、高锰酸钾(KMnO4)0.036 g]，称0.2 g NaYF4:Yb,Er用正己烷和乙醇超声3次，22 000 r/min离心,向离心产物中加入100 mL环己烷、70 mL叔丁醇、10 mL去离子水和5 mL 5%的碳酸钠(Na2CO3),搅拌20 min；向混合物加入30 mL Lemieux-von Rudloff氧化剂，将混合物于40 ℃搅拌24 h，将产物，22 000 r/min离心30 min，洗涤再离心上述产物；将产物分别分散在50 mL(pH4～5)盐酸中,搅拌30 min后经11 000 r/min，离心30 min、70 ℃干燥备用。NaYF4:Yb,Tm的表面修饰方法用NaYF4:Yb,Er的表面修饰。

1.2.3透射电镜 将待检测样品充分分散后取适量放置到铜网上压片检测，用电镜观察UCNPs形貌及尺寸(加速电压100 kV；点分辨力 0.24 nm)。

1.2.4荧光分光光度计检测 将待测样品调制10 mg/mL,室温下将样品用连续激发980 nm激光器的荧光光谱仪进行测定，扫描范围200～800 nm；

1.2.5傅立叶红外光谱仪检测 取干燥样品与溴化钾(KBr,1∶100)研磨成细粉状，压片后置傅立叶红外光谱中分析颗粒表面的化学基团，扫描范围250～4 000/cm。

《舌尖上的中国》里有一段话：在这个时代，每一个人都经历了太多的苦痛和喜悦，中国人总会将苦涩藏在心里，而把幸福变成食物，呈现在四季的餐桌之上。

1.2.6结直肠癌细胞DLD1培养 将DLD1细胞置含10%胎牛血清的DMEM培养瓶中，37 ℃、5% CO2培养箱孵育。弃DMEM培养液[含青霉素钠100 IU/L，链霉素100 IU/L(pH7.2～7.4]，加入2～3 mL 0.25%胰酶消化，待细胞变圆或细胞间隙增宽时，终止消化，收集细胞离心，弃胰酶消化液，加入新鲜DMEM培养液，制成细胞悬液，按1∶3传代至培养瓶中。

1.2.7四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测UCNPs对DLD1细胞抑制率 取对数生长期的DLD1细胞，用0.25%胰蛋白酶消化制备细胞悬液，96孔板接种DLD1细胞5.0×104/孔，设阴性对照组及调零组，每孔加不同浓度的UCNPs(NaYF4:Yb,Er或NaYF4:Yb,Tm 0、50、100、200、400、800、1 600 μg/mL)，每组设7个复孔,培养24 h；加入MTT(5 mg/mL)20 μL后继续培养4 h，弃培养基，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150 μL,振荡10 min,在酶标仪570 nm下检测吸光度(OD)值(用630 nm校准)；计算UCNPs对细胞抑制率，本实验重复3次；细胞抑制率=1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。NaYF4:Tm对DLD1细胞抑制率检测方法同NaYF4:Yb,Er的检测方法。

1.2.8制备CD44v6 UNCPs探针 取氧化的NaYF4:Yb,Er 10 mg分别加入MES缓冲液洗涤后离心，加7 mL MES缓冲液、5 mg EDC、15 mg NHS，磁力搅拌器反应1 h；将产物用PBS洗涤，11 000 r/min离心30 min；将产物放入3 mL PBS经0.22 μm过滤器滤过后，加入10 μL CD44v6单克隆抗体，室温反应2 h，既得NaYF4:Yb,Er-CD44v6探针，4 ℃保存备用。NaYF4:Yb,Tm-CD44v6探针制备方法同NaYF4:Yb,Er-CD44v6。

1.2.9DLD1干细胞光热治疗 利用980nm激光器激发结合CD44v6 UCNPs探针对结直肠癌CSC进行光热治疗。

1.3统计学处理 采用SPSS17.0软件分析数据，各实验组与对照组细胞抑制率比较采用方差分析(Analysis of Variance)，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1NaYF4:Yb,Er/Tm的表征 透射电镜对NaYF4:Yb，Er和NaYF4:Yb,Tm进行形貌、晶体结构表征观察，结果显示，两种UCNPs经谢勒公式计算，粒子直径20～35 nm，均为六角相的UCNPs，图1A、C图示两种UCNPs均有良好分散性，图1B、D示两种UCNPs在受到电子束激发时均具有同心圆环组成的选区多晶电子衍射图样。

A:NaYF4:Yb,Er图像；B:NaYF4:Yb,Er电子衍射图；C:NaYF4:Yb,Tm图像；D:NaYF4:Yb,Tm电子衍射图

图1 透射电镜对NaYF4:Yb,Er/Tm进行表征观察

图2 NaYF4:Yb,Er/Tm上转换发光光谱图

2.3NaYF4:Yb,Er/Tm表面修饰后表征 傅立叶红外光谱检测修饰前、后的NaYF4:Yb,Er/Tm。结果如图5～6示，图5、6中黑色线分别代表NaYF4:Yb,Er/Tm氧化前的振动光谱，图5绿色线代表NaYF4:Yb,Er氧化后的振动光谱，图6蓝色线代表NaYF4:Yb,Tm氧化后的振动光谱，均在～1 640/cm处发现羧基(-COH)基团的伸缩振动谱，而在～3 417/cm处表现出宽频带吸收峰，对应羟基(-OH)基因的伸缩振动谱，UCNPs氧化后的振动谱比氧化前明显增强，证实NaYF4:Yb,Er/Tm氧化后-COOH的存在，表明NaYF4:Yb,Er/Tm修饰成功。

图3 NaYF4:Yb,Er上转换发光机制

图4 NaYF4:Yb,Tm上转换发光机制

黑色线：NaYF4:Yb,Er氧化前振动光谱，绿色线：NaYF4:Yb,Er氧化后振动光谱

图5 NaYF4:Yb,Er氧化前后红外光谱

2.4MTT检测2种UCNPs对DLD1细胞抑制率 NaYF4:Yb,Er(表1)和NaYF4:Yb,Tm(表2)细胞毒性分析结果显示，1 600 μg/mL高浓度组细胞抑制率与阴性对照组(0 μg/mL)比较差异有统计学意义(NaYF4:Yb,Er,P=0.003；NaYF4:Yb,Tm,P=0.000)，其余各组与阴性对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)，实验时采用中剂量浓度组(400 μg/mL)，所合成的NaYF4:Yb,Er/Tm在实验过程中对肿瘤细胞无毒性。

黑色线：NaYF4:Yb,Tm氧化前振动光谱，蓝色线：NaYF4:Yb,Tm氧化后振动光谱

图6 NaYF4:Yb,Tm氧化前后红外光谱

2.5NaYF4:Yb,Er/Tm荧光成像 用980 nm激光器分别对NaYF4:Yb,Er和NaYF4:Yb,Tm进行2 W/10 s连续红外光激发，分别获取粒子的明、暗场图像和荧光像，并对图像进行合并,以证明上转换得到的红、绿色荧光像和蓝色荧光像是纳米粒子本身受到激发所得。结果显示(图7)：采用980 nm连续激发取样拍照。从图7F中清晰得到NaYF4:Yb,Er红、绿两种荧光，从成像图中可证实合成的纳米粒子具有良好的发光性，且发光不受时间限制。

2.6CD44v6 UCNPs探针靶向DLD1 CSC荧光成像 12孔培养板每孔加入500 μL CD44v6 UCNPs探针，置37 ℃、5% CO2培养箱培养2 h，弃上清液，加1 000 μL PBS。DLD1细胞与探针共孵育后用PBS代替DMEM培养基以减少培养基中颜色对980 nm激光的影响。CD44v6-NaYF4:Yb,Er探针上转换成像结果(图8)示：CD44v6表达于细胞膜，尤其处于分裂晚期的细胞之间蛋白表达量明显增多，CD44v6蛋白表达符合干细胞不对称分裂特性。CD44v6-NaYF4:Yb,Tm探针上转换成像图(图9)中可见荧光成像在肿瘤细胞表面呈簇状分布或呈点状分布，提示肿瘤细胞成像时对于发光较弱的荧光信号可以加大激发功率或延迟激发时间以便得到清晰图像。

A：NaYF4:Yb,Er明场像;B：绿色荧光暗场像;C：A、B明场与暗场合并像;D：红色荧光暗场图;E：A、D明场与暗场合并像;F：NaYF4:Yb,Er明、暗场、红绿色荧光合并像;G：NaYF4:Yb,Tm明场像;H：蓝色荧光暗场像;I：G、H明、暗场合并像

图7 UCNPs上转换成像图

A:明场像;B:绿色荧光暗场像;C:A、B明暗场合并像;D：红色荧光暗场像;E：A、D明暗场合并像;F：红、绿色荧光合并成黄色荧光像

图8 CD44v6-NaYF4:Yb,Er上转换荧光成像

A：明场像;B：蓝色荧光暗场像;C：明暗场合并像

图9 CD44v6-NaYF4:Yb,Tm上转换荧光成像

A、B:1 W/50 s;C、D：2 W/50 s;E、F：3 W/50 s;G、H：4 W/50 s;I、J:5 W/50 s;K、L：6 W/50 s;M、N：7 W/50 s;O、P：8 W/50 s

图10 肿瘤细胞光热治疗

2.7DLD1 CSC的靶向光热治疗 鉴于蓝色荧光转换为热能效率高的特点，本实验选择被激发后发蓝光的CD44v6-NaYF4:Yb,Tm探针，以不同功率不同时间的980 nm连续激发后，明确蓝光转换为热能对细胞损伤的阈值,如图10A～F示经1～3 W/50 s 980 nm激发后细胞形态未见明显异常；图10G、H图显示4 W/50 Rs 980 nm连续激发细胞后可见分裂末期两个子细胞连接处明显萎缩；图10I、J和图10K、L分别经5、6 W/50 s激发后部分细胞萎缩，包括细胞膜皱缩，细胞体积变小；图10M、N示经7 W/50 s激发后细胞核核仁皱缩成团块状凝集，部分细胞核仁呈块状分布；图10O、P示经8 W/50 s激发后细胞膜边缘皱缩部分呈肉芽状突起、破碎，细胞质内细胞器凝聚、蛋白质凝聚，细胞核部分核仁皱缩成团块状凝集。经上述不同功率980 nm激发照射，肿瘤细胞膜、细胞核等发生不同程度形态学变化。结果显示：DLD1细胞在受到近红外980 nm激发不超过3 W/50 s时，DLD1细胞不会受到明显影响，因此，后续细胞光热治疗以4 W/50 s作为治疗阈值。

A：明场像;B：暗场像;C：明暗场合并像;D：4 W/50 s荧光暗场像;E：4 W/50 s连续激发后明场像;F：治疗前、后合并像显示细胞体积明显固缩

图11 CD44v6-NaYF4:Yb,Tm光热损伤成像图

以980 nm、4 W/50 s激发特异性结合的纳米探针(CD44v6-NaYF4:Yb,Tm对DLD1细胞进行光热治疗时)，结果如图11中可见，肿瘤细胞在经980 nm、4 W/50 s连续激发后其细胞体积明显固缩，细胞膜明显皱缩、破坏等病理形态改变。

表1 NaYF4:Yb,Er对肿瘤细胞抑制率

表2 NaYF4:Yb,Tm对肿瘤细胞抑制率

3 讨 论

结直肠癌确诊需术后病理切片证实，发现时多数已进入中晚期，目前，结直肠癌治疗仍以手术和化学药物治疗为主，但常规化学药物因无抗肿瘤细胞的特异靶向性，其在杀伤肿瘤细胞的同时也对正常组织细胞产生损伤，并且易引起肿瘤细胞的耐药性。随着对CSC的深入研究发现，CSC决定了肿瘤的复发和侵袭转移，同时肿瘤的耐药性也取决于CSC的耐药性[9-10]。因此，针对CSC的靶向治疗可能是有效的肿瘤治疗方案之一。目前，已有研究证实在多种恶性肿瘤如胃癌、结肠癌、肝癌等普遍存在CD44v6表达失控，CD44v6高表达与肿瘤侵袭、转移及预后等密切相关[7]，另外，TODARO等[11]在2014年发现CD44v6既可能是一个生物标记物也可能是结直肠癌CSC治疗性靶点之一。

基于以上研究，本实验制备NaYF4:Yb,Tm UCNPs，经NHS/EDC偶联CD44v6抗体的靶向探针，以期达到靶向结直肠癌CSC目的，并经分子成像技术实现对结直肠癌CSC的影像诊断及靶向光热治疗的作用鉴别，从而提高肿瘤治疗效果。实验结果显示，制备UCNPs直径为20～35 nm，粒径均匀；经傅立叶红外光谱检测UCNPs修饰成功，具有良好的生物相容性及水溶液分散性；MTT检测说明UCNPs实验用量对DLD1细胞无毒性。通过体外实验证实,该纳米探针对CD44v6+的结直肠癌CSC有良好的靶向性，可实现上转换荧光的实时成像，避免了生物发光成像中如荧光素酶半衰期的限制。关于UCNPs经980 nm激光器激发后是否对细胞本身造成影响的报道并不多见，SHEN等[12]报道HeLa细胞在接受近红外激光获得的辐射前、后显微镜图像的对比图发现，其细胞形态并没有明显差异。而高温杀伤肿瘤细胞的具体作用机制目前仍未完全明确，一般认为有多种作用机制：高温能够破坏细胞核，尤其当温度超过41 ℃时，细胞核、染色质可凝集成团块，使蛋白质凝固变性，最终导致细胞死亡，并产生新的溶酶体使细胞发生自身溶解[13]，而激光作用于生物组织后，可以引起各种物理化学效应，因此使用激光治疗各种疾病已被广泛应用[14-15]。目前，针对肿瘤细胞热治疗多数研究的重点是光动力学治疗[16]，但采用UCNPs本身作为直接热杀伤肿瘤细胞的研究未见报道，因此本研究主要针对UCNPs本身在受到不同时间、不同功率980 nm激发后其局部的产热作用，以达到杀伤结直肠癌CSC的目的，其研究结果显示：DLD1 CSC经980 nm、4 W/50 s连续激发后其细胞体积明显缩小，部分细胞核呈团块状凝集、固缩，细胞膜皱缩等病理改变，此研究结果表明UCNPs可在980nm激发后具有直接杀死肿瘤CSC的作用。

综上所述，通过使用靶向纳米探针，可实现对肿瘤CSC的实时无创性影像学诊断，又可实现对其靶向精准光热治疗，从而达到在杀死CSC的同时又达到了常规化学药物不能达到的治疗效果；同时，靶向纳米探针可避免CSC耐药性的产生，进而提高常规化学药物对一般肿瘤细胞的治疗效果。因此，UCNPs探针是一种具有良好应用前景的治疗方案之一。本实验下一阶段将进一步探讨UCNPs探针在体内对肿瘤的荧光成像及光热治疗作用，以及靶向纳米载药体系的构建和应用。