菊芋叶绿体分离方法比较研究

许盼盼,杨世鹏,王丽慧,孙雪梅，3,高洁铭,李 莉,3,钟启文,3

(1.青海大学 农林科学院 青海省蔬菜遗传与生理重点实验室，西宁 810016；2.青海大学 农牧学院，西宁 810016; 3.青海大学 三江源生态和高原农牧业国家重点实验室，西宁 810016)

菊芋(HelianthustuborosusL．)又称洋姜，菊科向日葵属植物，是一种多年宿根性草本植物[1]。其块茎中富含大量果聚糖，可作为生物、医药、能源、食品加工等方面的原材料，是一种多糖类新兴能源作物[2]。近年来，国内外对菊芋的研究主要集中于抗逆性[3]、品种选育[4]、种质资源和遗传特性[5]、能源转化利用[6]和果聚糖代谢调控[7]等方面。目前，针对菊芋叶片的研究主要集中在其抗氧化、抗菌活性、绿原酸与黄酮类的提取工艺及其吸附性等方面。罗安凯[8]研究发现，菊芋茎叶对重金属离子有较好的吸附作用，孙鹏程[9]研究发现，菊芋叶片可以作为提取绿原酸的一个新植物来源；郑晓涛[10]研究发现，菊芋茎叶黄酮类化合物中的抗氧性组分主要存在于菊芋叶片中，其在食品和药品中可作为抗氧化剂等。

叶绿体(Chloroplast)是植物光合作用的主要器官，是一切生命活动的物质来源，同时其具有独立的遗传系统[11]。它普遍存在于绿色植物、藻类的色素，在绿色植物进行光合作用的过程中，相对于其他细胞器，叶绿体起着能量转化的重要作用[12]。叶绿体中同时进行着多种物质的合成，例如脂肪酸、淀粉、氨基酸等[13]。叶绿体基因组(Chloroplast DNA, cpDNA)是一种闭合环状双股结构，含有10～30个基因，编码200个蛋白质。植物细胞中，细胞核、线粒体以及叶绿体都携带着DNA等遗传物质[14]。与核基因相比，细胞器基因组虽不具备大分子量与高复杂性，却有着分子量小、结构简单及多拷贝的特点[15]。

叶绿体作为植物细胞的重要细胞器，其本身完整的基因组研究在植物基因组学的研究中越来越重要。提取高质量菊芋叶绿体基因组DNA是开展叶绿体基因组组装测序的关键一步，目前常用的植物叶绿体DNA提取方法有：无水法[16]、DNaseⅠ法[17]、改良高盐-低pH法[18]、试剂盒法、离心法[19]等。谢海坤等[20]在中国野生葡萄叶绿体分离及叶绿体DNA提取的研究中发现，柱式植物叶绿体DNA提取试剂盒和改良高盐-低pH法均分离得到中国野生葡萄的叶绿体，但改良高盐-低pH法得到的cpDNA浓度高、杂质少；刘少林等[21]利用DIECA和PVP，对高盐-低pH法进行改进，并提取分离棉花叶片的叶绿体基因组，得到的cpDNA无杂质污染，电泳条带清晰无拖尾；陆丹等[22]采用高盐-低pH法和CTAB法提取高粱叶片的cpDNA，并对缓冲液SDS浓度进行优化，比较发现高盐-低pH法提取高粱基因组DNA效果更好；梁凤萍等[23]对27种菊科植物的叶绿体进行全基因组序列分析，提供了菊科植物分类鉴定和定位的依据，而对菊芋cpDNA的提取方法未报道。本试验通过对比植物组织叶绿体DNA萃取试剂盒中物理法、化学法、Percoll密度梯度离心法、高盐-低pH法和差速离心分离法，以期筛选出适合菊芋cpDNA提取的最佳方法，为菊芋和其他菊科作物叶绿体基因组的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取青海农林科学院研发中心资源苗圃中的菊芋‘青芋1号’叶片。于2017-08-04采集菊芋成熟期的枝干顶端幼嫩叶片，用蒸馏水清洗干净，滤纸吸干表面水分，避光，置于4 ℃，备用。

1.2 菊芋叶绿体的提取

1.2.1 改良高盐-低pH法 在叶绿体的提取与纯化过程中加入氯仿∶异戊醇=24∶1(体积比) 1 mL，颠倒离心管5 min，12 000 r/min离心10 min，转移上清液至新离心管，对照上面的方法重复抽提5次。加入2 mL 20 ℃预冷的无水乙醇及2 mL乙酸钠溶液(2.4 g/L)和24 mmol CTAB/NaCl溶液1 mL，混匀后-20 ℃静置2 h沉淀析出DNA，4 ℃ 13 000 r/min离心10 min，回收DNA沉淀。沉淀用φ=75%乙醇漂洗2次，置于室温干燥。加入800 μL TE(Tris-EDTA buffer solution)缓冲液(购自北京索莱宝科技有限公司)和10 μL的RNaseA，37 ℃下反应4 h。小心颠翻离心管 5 min，10 000 r/min离心10 min，转移上清液。上清液加φ=1/10乙酸钠溶液(2.4 g/L)，混匀后加无水乙醇(-20 ℃预冷)2 mL，4 ℃ 13 000 r/min离心10 min，弃上清，用φ=75%乙醇漂洗1次，室温干燥，加入TE缓冲液20 μL溶解并混匀沉淀，-20℃保存，备用。其他步骤均参考黎金燕等[24]的方法。

1.2.2 GENMED试剂盒物理法和GENMED试剂盒化学法 GENMED试剂盒购自上海杰美基因医药科技有限公司，将菊芋叶片去中脉并切小，称取1 g。放入暗室4 ℃过夜，液氮研磨，按使用说明书进行。

1.2.3 Percoll密度梯度离心法 将菊芋叶片去中脉并切小，称取10 g。放入暗室4 ℃过夜，液氮研磨，后续步骤参考Michaud等[25]。

1.2.4 DNaseⅠ差速离心法 将叶片去中脉并切小，称取20 g。放入暗室4 ℃过夜，后续步骤参考姜少俊等[26]。

1.3 菊芋叶绿体显微镜观察

分别从以上5种方法提取的cpDNA粗提液中吸取20 μL，制作临时载玻片，在奥林巴斯BX53显微镜下经40×物镜观察提取得到的叶绿体细胞的情况并拍照。

1.4 菊芋cpDNA质量检测与电泳检测

cpDNA浓度和纯度检测：从备用的cpDNA样品中吸取2 μL，用核酸蛋白检测仪(北京天根生化科技有限公司)测定cpDNA浓度，用ddH2O作空白对照校0点，记录OD260/OD280、OD260/OD230和cpDNA浓度，其中标准DNA OD260/OD280在1.80～2.0，OD260/OD230在0.8～1.2，根据OD260/OD280和OD260/OD230评价cpDNA质量。

凝胶图谱检测：从备用cpDNA液中吸取 2 μL，稀释10倍。吸取稀释液2 μL，加2 μL的 6×DNA loading buffer染色，以λDNA HindⅢ为marker，在10 g/L琼脂糖凝胶上用恒压80 V电泳50 min后，在Bio-Rad Gel Doc XR+凝胶成像系统上观察结果并拍照。

1.5 PCR引物扩增

随机选取RAPD引物4对[27]，分别以5种方法提取的cpDNA为模板进行PCR扩增反应(PCR引物扩增的试剂均购自北京天根生化科技有限公司)。PCR反应体系：总反应体系为25 μL，其中包括2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL、引物1 μL、ddH2O 10.5 μL、模板cpDNA 1 μL。PCR扩增条件：95 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，40 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s，循环42次；72 ℃延伸5 min。用10 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，Bio-Rad 凝胶成像系统进行拍照分析。引物名称及序列见表1。

表1 引物名称及序列Table 1 The name and sequence of primers

2 结果与分析

2.1 5种方法分离菊芋叶绿体电镜观察结果

通过显微镜对5种提取方法得到的菊芋叶绿体粗提液观察发现，在40×物镜下分别得到分离的叶绿体、叶绿体个数及形状。根据(图1)对比发现DNaseⅠ差速离心法分离出的叶绿体最少，改良高盐低-pH法得到的叶绿体数目多，含量高；相比较而言，其他4种方法分离得到的菊芋叶片叶绿体含量、数目较少。从表2可以看出，5种方法提取分离的叶绿体细胞均呈现扁圆形，且改良高盐-低pH法分离出的叶绿体个数高达610个。因此，改良高盐-低pH法能分离出更高质量的菊芋叶绿体。

2.2 菊芋cpDNA质量检测与电泳检测

2.2.1 核酸蛋白检测仪检测结果 对5种方法分离后提取的cpDNA进行核酸蛋白检测仪检测，分析菊芋cpDNA的浓度和不同波长下吸光度数值，从表2中可知，5种方法提取的cpDNA指标差异显著，除了改良高盐-低pH法提取的OD260/OD280高于1.8外，其他4种提取的OD260/OD280低于1.8，为1.353～1.750，低于纯净DNA(1.8～2.0)；DNaseⅠ差速离心法和Percoll密度梯度离心法OD260/OD230高于纯净DNA，表明这2种方法提取的样品中可能有较多的未纯化完全的多糖和多酚类物质；对比5种方法提取的cpDNA浓度发现，高盐-低pH法的cpDNA质量浓度可达到295.63 μg/μL。结果表明改良后的高盐-低pH法提取菊芋叶片中的cpDNA纯度较好。由上述结果看出，高盐-低pH法提取cpDNA质量较高，糖类及酚类物质污染较轻，因此，更能满足植物叶绿体基因组建库测序的要求。

2.2.2 凝胶电泳检测结果 由10 g/L琼脂糖凝胶电泳的结果(图2)看出：高盐-低pH法、GENMED试剂盒物理法有明显的条带， GENMED试剂盒化学法、Percoll密度梯度离心法、DNaseⅠ差速离心法没有条带。GENMED试剂盒化学法条带比高盐-低pH法条带的亮度有所降低，可能由于多糖的干扰；GENMED试剂盒化学法的条带几乎看不清楚，说明cpDNA有降解；Percoll密度梯度离心法和DNaseⅠ差速离心法没有条带，表明cpDNA浓度较低且降解。相反高盐-低pH法条带清晰、整齐，亮度均匀，完整性较好。通过对比可知，高盐-低pH法提取的cpDNA产量高于其他方法，即提取cpDNA的质量好于其他方法，与核酸蛋白检测仪的定量分析结果吻合。

A.GENMED试剂盒物理法 Physical method of GENMED kit；B.GENMED试剂盒化学法 Chemical method of GENMED kit；C.DNaseⅠ 差速离心法 DNaseⅠdifferential centrifugation；D.Percoll密度梯度离心法 Percoll density gradient centrifugation method； E.改良的高盐-低pH法 Improved High salt-low pH method

图1 5种方法分离提取菊芋叶绿体显微图片Fig.1 The micrographs of chloroplast isolate by five methods

表3 5种方法提取菊芋cpDNA质量的检测结果Table 3 The quality of cpDNA extracted from Jerusalem artichoke by five methods

M.λDNA/Hind Ⅲ marker；1.改良高盐-低pH法 Improved high salt-low pH method；2.GENMED试剂盒物理法 Physical method of GENMED kit；3.GENMED试剂盒化学法 Chemical method of GENMED kit；4.Percoll密度梯度离心法 Percoll density gradient centrifugation method；5.DNaseⅠ差速离心法 DNaseⅠdifferential centrifugation;下同 The same below

图2菊芋cpDNA电泳检测
Fig.2ElectrophoresispatternofchloroplastDNAextractedfromJerusalemartichoke

2.3 PCR扩增

使用5种方法提取的cpDNA分别对4对RAPD的引物进行PCR扩增，经10 g/L琼脂糖凝胶电泳的扩增，结果显示(图3)，在4对RAPD引物的扩增结果中，改良高盐-低pH法cpDNA在4对RAPD引物中均扩增特征标记图谱，条带清晰，带型一致；GENMED试剂盒物理法cpDNA在第4对引物中未扩增出特征标记条带；GENMED试剂盒化学法的cpDNA只在第A对和第D对引物扩增出特征标记图谱，而在A引物中的扩增条带几乎看不到，在第B对和第C对引物中未扩增出特征标记图谱；Percoll密度梯度离心法、DNaseⅠ差速离心法的cpDNA在4对RAPD引物中均未扩增出特征标记图谱。因此，进一步验证了高盐-低pH法提取的菊芋cpDNA的完整性。

M.D2000 marker; A.OPA10;B.OPE02;C.OPS12;D.OPS15

3 讨 论

提取高质量菊芋叶绿体基因组DNA是开展叶绿体基因组组装测序的关键一步，然而在cpDNA提取过程中，叶绿体较难分离，同时存在核DNA与线粒体DNA污染情况。此外，不同植物具有不同特性，选取方法、试剂等因素均会导致植物cpDNA提取效果不同[15-19]。目前，没有专门针对提取菊芋叶片cpDNA的方法，因此，筛选出适合菊芋cpDNA 的提取方法十分重要。本试验在参考其他植物cpDNA分离提取方法的基础上，选择5种常见的cpDNA 提取方法对菊芋cpDNA的提取效果进行比较，发现5种方法均可提取到菊芋cpDNA。试剂盒法操作虽然快速、简单，但获得的cpDNA含量较少，成本较高[28]；Percoll密度梯度离心法操作比其他方法繁琐，同时成本高、耗时长、产率低[29]；DNaseⅠ差速离心分离法很难得到完整叶绿体膜、纯度以及含量都较低[30]；而改良高盐-低pH法不仅操作简单，且可快速获得完整叶绿体以及高质量、高产率的cpDNA[31]。

菊芋中富含大量的果聚糖，其占菊芋块茎鲜质量的20%或者干物质量的90%，由于糖类物质的存在对DNA分离、纯化及cpDNA的稳定性造成一定困难，赵孟良等[32]在提取菊芋DNA过程中进行改良，避免多糖类物质对DNA质量的影响。本试验在其他植物cpDNA提取方法的基础上，加入24 mmol CTAB/NaCl溶液1 mL，以减少混入多糖对cpDNA的影响，结果较为明显，利用改良高盐-低pH法提取的cpDNA含量和质量均比较高。试验过程中使用商品化的TE(Tris-EDTA buffer solution)缓冲溶液，减少了试剂配制的步骤，且易于溶解。此方法提取及获得的cpDNA条带清晰、干净且亮度高，其中OD260/OD280为1.926，质量浓度为295.63 μg/μL，表明提取的菊芋cpDNA质量高，纯度高，是一种较合适的菊芋cpDNA提取方法，可为后续的菊芋cpDNA其他分子研究奠定基础。