萝卜根径发育候选基因的初步筛选

杜雪玲 ，马媛媛，程洋洋，何 军，宋运贤， 余如刚

(1.淮北师范大学 生命科学学院，安徽淮北 235000；2.北京阳光绿地生态科技有限公司，北京 100083)

萝卜(RaphanussativusL.)属十字花科萝卜属，1 a、2 a生草本植物。肉质直根为萝卜主要贮藏和食用器官，它的形成与产量和品质紧密相关[1-2]。肉质直根的形状和大小在萝卜品种间存在基因型差异，直径为1～30 cm，长度为3～2 m[3]。通常育种家通过选育不同根大小的萝卜满足消费者的需求。因此，揭示萝卜肉质直根膨大形成的分子调控机制非常重要。

目前，对萝卜肉质直根的形态和解剖学已有深入的研究，发现萝卜肉质直根的增粗是由维管束形成层的活动产生次生木质部(主要)和韧皮部，以及薄壁细胞分裂和膨大而形成[1,4]。另据萝卜肉质直根形成膨大的生理生化研究表明，肉质直根的膨大还受到激素和环境因子的影响[5-6]。植物生长发育期间，器官的形成是基于基因持续表达及其组织或发育时期的特异性基因表达的结果。然而，有关决定萝卜肉质直根大小的关键基因分离及其形成的分子机制尚鲜有报道。

近年来，随着组学测序技术的发展，基于新一代高通量测序平台的数字基因表达谱(Digital gene expression profiling， DGE)技术已广泛应用于植物贮藏根生长发育过程中的基因差异表达分析，如胡萝卜[7]、芜菁[8]、莲藕[9]和甘薯[10]等，阐明了植物贮藏根生长发育的分子生物学基础。Yu等[11]运用基于高通量测序的DGE技术，对萝卜‘NAU-YH’不同发育时期(破肚前期、破肚期和膨大期)的肉质直根进行测序，并获得大量的差异表达基因及其功能注释和富集调控网络。萝卜全基因组序列已被日本学者公布[12]，基于此序列，Xu等[13]利用高通量测序技术对长形萝卜不同发育时期(7、14、20、60、90 d)的根和叶进行基因差异表达分析。尽管高通量测序技术已成功鉴定到参与肉质直根生长发育的大量候选基因，但利用DGE技术对不同基因型间萝卜肉质直根直径大小的差异表达基因研究鲜有报道。本研究以公开的萝卜基因组为参考序列，利用数字基因表达谱技术，对2种根直径大小不同的圆球形萝卜 ‘扬州圆白’(直径大)和‘萨丁’(直径小)在破肚期和膨大期的基因表达情况进行分析。利用生物信息学手段，对差异表达基因进行注释和功能分类。以期洞察调控萝卜肉质根大小的分子机制，为进一步基因功能验证奠定基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料培养及处理

以圆球形萝卜‘扬州圆白’(肉质根直径10 cm左右，YB)和‘萨丁’(肉质根直径2～3 cm， SD)为材料，挑取整齐饱满基本一致的种子，经过φ=1%次氯酸钠溶液消毒，于25 ℃黑暗培养，萌发后于营养钵中培养，温度：白天25 ℃/夜晚18 ℃，光照16 h。播种后1周间苗，每盆留3株苗，每个品种6盆。分别采集培养时间为播后 20 d(破肚期)和播后40 d(膨大期)的萝卜肉质直根材料。取样后，将每盆中根样品(3株/盆)用蒸馏水洗涤，等量混合在一起、切碎，液氮速冻，保存于-80 ℃冰箱中，备用。

1.2 方 法

1.2.1 总RNA提取及质量检测 分别将YB和SD萝卜肉质直根2个不同发育时期(播后20 d和40 d)的根样品等量混合，然后采用Trizol试剂盒(Invitrogen,USA)分别提取YB和SD混合根样品的总RNA，操作步骤参照试剂盒提供的说明书进行。利用Nanodrop检测RNA的纯度(OD260/OD280≥1.8)，采用Agilent 2100检测RNA的完整性。

1.2.2 DGE文库构建和Illumina测序 DGE文库构建和数字基因表达谱测序是在北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行(Novogene,Beijing,China)。将提取的YB和SD萝卜的肉质根总RNA，分别用于构建2个DGE文库(YB和SD库)。其步骤如下，利用带有Oligo(dT)的磁珠，通过A-T互补配对与mRNA的ployA尾结合的方式富集纯化mRNA，并加入缓冲液，将其打断成短片段，再以片段化后的mRNA为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合成一链cDNA，然后加入缓冲液、dNTPs和DNA polymerase Ⅰ合成二链cDNA，随后利用AMPure XP beads纯化双链cDNA；合成的双链cDNA经末端修复、加A尾并连接测序接头，接着用AMPure XP 体系进行片段大小选择，然后进行PCR富集得到最终的DGE文库；构建好的文库使用Agilent 2100 system进行质量检测，合格后进行Illumina HiSeq测序(参照诺禾致源测序结题报告)。

1.2.3 差异表达基因筛选 为了提高筛选萝卜根大小品种间差异关键基因的准确性，本研究差异表达基因筛选方法参照Pimentel等[14]，结合基于泊松分布的DEGseq和基于贝叶斯推断法的Cuffdiff2两种方法进行基因的差异表达分析。其中，DEGSeq采用TMM(Trimmed mean of M-values，M-值的加权截尾均值)对基因序列数(read count)数据进行标准化处理，以设定阈值错误发现率(false discovery rate，FDR)q-value <0.005和 |log2fold change|≥ 1(fold change为差异倍数)作为基因差异表达的评判标准；而Cuffdiff2软件采用FPKM(Expected number of Fragments Per Kilobase of transcript sequence per Millions base pairs sequenced，每百万片段中来自某一基因每千碱基长度的片段数目)对read count数据进行标准化处理，以q-value < 0.05和 |log2fold change| ≥ 1作为基因差异表达的评判标准。最后，取2种方法获得的差异表达基因交集作为本研究进一步分析数据。

1.2.4 RT-qPCR分析 利用Trizol试剂盒(Invitrogen,USA)，在YB和SD中，分别提取肉质直根2个不同发育时期(播后20 d和40 d)的总RNA，命名为YB20、YB40、SD20和SD40。然后使用PrimeScript○RRT 试剂盒 (Takara,Dalian,China)将各时期的总RNA反转录为cDNA。从鉴定的差异表达基因中选择6个与细胞壁代谢酶相关的候选基因进行RT-qPCR分析。利用Beacon Designer 7.0软件对基因的特异引物进行设计(表1)。RT-qPCR反应在实时荧光定量PCR仪(ABC7300)中进行。PCR反应程序参考文献[15]。每个样品有3次生物学重复(将每盆3株苗的根样品等量混合形成1个生物学重复)，且每个生物学重复有3次技术重复；以β-Actin基因为内参基因，按照 2-ΔΔCT法计算特异基因相对表达量。

1.3 数据处理

运用Microsoft Excel 2010计算每个基因在生物学重复中的标准差，对同一个基因在2个品种肉质根不同发育时期的结果做t检验，以P<0.05作为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 测序概况及其参考序列比对结果分析

以YB和SD破肚期和膨大期的肉质根为材料构架2个数字基因表达文库，分别获得YB和SD原始序列总数分别为9 971 691 个和11 089 789个，经去除接头污染、N(无法确定碱基信息)含量超过10%和低质量序列，YB和SD各库净序列总数分别获得9 930 954个和11 036 869个(表2)。

表1 用于RT-qPCR分析的引物Table 1 Primers used for RT-qPCR analysis

将获得的净序列总数与参考基因组比对分析，发现2个DGE文库当中有80%(YB：8 550 057，86.10%；SD：8 933 608，80.94%)以上的净序列总数能够成功定位到参考基因组上，说明参考基因组选择合适，而且相关试验不存在污染(表3)。同时，发现YB和SD文库中，比对到基因组上的序列数分别有8 172 997和8 509 539个为唯一匹配，这些序列数将被用于差异表达基因的筛选(表3)。

2.2 差异表达基因筛选

利用DEGseq在YB和SD文库中共获得3 666个差异表达转录本，Cuffdiff2共获得1 924个差异表达转录本。求交集，共筛选出1 468个差异表达转录本，其中有1 369个转录本在YB和SD中共同表达，占所有差异表达基因的93.3%。另外，有48和51个差异表达转录本分别在YB和SD中特异性表达，分别占所有差异表达基因的3.3%和3.5%(图1)。

2.2.1 参与细胞壁代谢的差异表达基因鉴定 植物细胞的生长与细胞壁伸展性密切相关[16]。本研究共鉴定到28个差异表达转录本编码的关键酶参与细胞壁代谢(表4)。其中，编码细胞壁降解酶有20个差异表达转录本，相比SD，大多数编码细胞壁降解酶的转录本在YB中上调表达，如内切葡聚糖酶(endoglucanase,EG,2/2)、多聚半乳糖醛酸酶抑制剂(Polygalacturonase inhibitor,PGIP,4/5)、果胶酯酶/果胶酯酶抑制剂(Pectinesterase/pectinesterase inhibitor,PMEI,2/4)、果胶(甲)酯酶(pectinesterase,PE,1/1)和木葡聚糖内糖基转移酶/水解酶(xyloglucan endotransglycosylase/hydrolase,XTH,5/5)；多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase,PG,)在YB中有1个差异转录本上调和2个下调表达。令人惊奇的是，纤维素酶(cellulase)在SD和YB比较中没有差异表达。另外，YB与SD比较中，编码细胞壁合成酶有3个差异表达转录本，包括1个编码木葡聚糖转移酶4(Xyloglucan glycosyltransferase 4,CSLC4)和2个编码纤维素合成酶类似蛋白(Cellulose synthase-like protein,CSLD2和CSLD3)的转录本，在YB中均上调表达(表4)。

表2 原始数据产出组成Table 2 The component of sequencing raw data in YB and SD

表3 测序序列与萝卜基因组比对结果Table 3 The blast result of the reads with radish genome

图1 YB和SD品种间差异表达基因维恩图Fig.1 The Venn of differential expression genes (DEGs) between YB and SD

此外，还发现了2个参与细胞壁代谢调控的关键因子，糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白(COBRA,COB)和扩展蛋白(expansin,EXP)在YB与SD比较中差异表达。与SD相比较，大多数编码EXP蛋白(3/4)和COB蛋白(1/1)的差异转录本在YB中上调表达(表4)。

2.2.2 参与蔗糖代谢的差异表达基因鉴定 肉质直根是萝卜碳水化合物和蛋白质的贮藏库，参与蔗糖代谢的酶在肉质根的形成过程中发挥了重要的作用[17]。本研究共鉴定到编码参与蔗糖代谢途径的2个相关酶的2个差异表达转录本(表5)。YB与SD比较中，一个编码催化己糖磷酸化的己糖激酶(hexokinase 3,HK3)的转录本在YB中上调表达；一个编码蔗糖分解代谢中转化酶(beta-fructofuranosidase,AtBETAFRUCT)的转录本在YB中下调表达(表5)。此外，基于Cuffdiff2法，编码蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase,SPS)和蔗糖合成酶(Sucrose synthase,SuSy)的转录本在YB和SD比较中没有差异表达。

2.2.3 参与植物激素信号转导途径差异表达基因鉴定 植物激素信号对根的发育起关键作用[18]。本研究共鉴定到激素相关差异表达转录本29个，其中有4个、1个、1个、4个、1个、4个、13个和1个分别参与到生长素(auxin)、细胞分裂素(CTK)、赤霉素(GA)、脱落酸(ABA)、乙烯(ETH)、油菜素类固醇(BR)、茉莉酸(TA)和水杨酸(SA)的生物合成、代谢、激素信号转导途径等各个过程(表6)。这些差异转录本被分别匹配到SAUR、A-ARR、DELLA、PYR/PYL、PP2C、ABF、ERF2、TCH4、CYCD3、JAZ和NPR1等植物信号转导途径相关的基因家族(表6)。YB与SD比较中，SAUR家族匹配上的不同差异转录本表达不一致，在YB中即有上调表达又有下调表达；A-ARR、ERF2、TCH4、CYCD3和JAZ家族匹配上的不同差异转录本在YB中都上调表达。DELLA、PYR/PYL、PP2C、JAR1、ABF和NPR1家族匹配上的不同差异转录本在YB中都下调表达。另外，细胞分裂素、油菜素类固醇和茉莉酸相关的差异表达转录本，在YB中整体上调表达。相反，生长素、赤霉素、脱落酸和水杨酸在YB中整体下调表达。

表4 YB 和SD中参与细胞壁代谢的候选差异表达基因Table 4 Candidate DEGs involved in cell wall metabolism in YB and SD

表5 YB 和SD中参与蔗糖代谢的候选差异表达基因Table 5 Candidate DEGs involved in sucrose metabolism in YB and SD

表6 YB 和SD中参与植物激素信号转导途径候选差异表达基因Table 6 Candidate DEGs involved in pathway of plant hormone signal transduction in YB and SD

2.3 RT-qPCR验证

为了验证数字基因表达谱测序的可靠性和有效性，选取6个与细胞壁代谢相关的差异表达基因进行RT-qPCR验证(图2)。结果表明，6个差异表达基因在YB和SD萝卜肉质直根2个不同发育时期(播后20 d和40 d)具有明显的差异表达。其中，6 个差异基因在RT-qPCR验证表达模式与DGE测序所得结果基本相符。例如，PG和PMEI3在SD中的相对表达水平高于YB，且PG在SD的破肚期表达水平高于膨大期，相反，PMEI3在SD和YB中的膨大期较高。此外，CSLD3、EG17、XTH22和PGIP1在YB中的表达水平高于SD。这些结果也进一步证实基于RNA-Seq的数字基因表达谱测序的可靠性和有效性。

不同字母代表在P<0.05 水平显著性差异 Different letters indicate significant differences atP<0.05

图26个候选差异表达基因在YB和SD中不同根发育时期的RT-qPCR分析
Fig.2RT-qPCRanalysisofsixcandidateDEGswithdifferentdevelopmentstagesofrootsinYBandSD

3 讨 论

不同的萝卜品种中，肉质直根的大小和形状存在很大的差异。其形状和大小是影响运输效率、加工效率和消费的重要因素。由此，形状和大小不仅直接决定萝卜的产量和品质，而且也关系到产品的价格。因此，揭示不同萝卜肉质直根形状和大小形成的生理和分子机制具有重要意义。目前，有关萝卜肉质直根形状和大小形成的生理机制已有报道[4,19]。然而，有关决定萝卜及其他根菜类作物根大小和形状形成的关键分子机制知之甚少[20]。鉴于此，本研究利用DGE技术，对2种不同根直径大小的圆球形萝卜：‘扬州圆白’和‘萨丁’进行DGE文库构建以及测序分析，通过2种方法筛选求交集，共获得1 468个差异表达转录本。有1 369个(93.3%)转录本在YB和SD中共同表达，暗示这些基因在萝卜品种间根发育过程中具有功能保守性；另外，有48个(3.3%)和51个(3.5%)差异表达转录本分别在YB和SD中特异性表达(图1)，暗示这些基因可能是引起2个品种根直径大小差异的调控因素，这些结果为揭示萝卜肉质根大小和形状形成的分子机制奠定了基础。

细胞壁的力学特性通过调控细胞的扩张性来控制细胞的大小和形状，从而决定组织和器官的形态[21]。萝卜肉质直根的形成主要是次生木质部和次生韧皮部薄壁细胞生长的结果[1]。目前，已有研究证实几个细胞壁代谢相关的基因，如EXP[22]、COB[23]、XTH[24]通过影响细胞壁软化从而促进细胞体积的增大。本研究共鉴定出28个差异表达转录本与细胞壁代谢相关。其中，发现大多数编码EXP(3/4)、COB(1/1)、XTH(5/5)的转录本在YB中上调表达。暗示这3个基因可能是‘扬州圆白’和‘萨丁’萝卜肉质直根直径大小差异的影响因子。

蔗糖和己糖是植物中调节“库-源”关系的重要信号分子。萝卜肉质直根为主要的库器官。蔗糖作为光合作用的主要产物，为肉质直根的形成提供生长代谢原料[25]。与蔗糖代谢和积累紧密相关的酶主要有蔗糖磷酸合成酶(SPS)、蔗糖合成酶(SuSy)和蔗糖转化酶(INV)。有关蔗糖代谢对萝卜肉质直根形成的影响已有相关报道[26-27]。通过对不同根冠比萝卜研究发现，萝卜库的活性与SuSy基因密切相关，而不是INV[27-28]。由此推测SuSy可能是调节肉质根蔗糖水平、控制肉质根库活性的关键酶。但是，基于KEGG途径分析，本研究仅筛选出1个参与蔗糖代谢的酶家族的差异表达转录本，即转化酶基因ATBETAFRUCT4(Rsa1.0_00018.1_g00046.1)在YB中下调表达，暗示ATBETAFRUCT4可能参与‘扬州圆白’和‘萨丁’萝卜肉质直根直径大小差异的调控。相反，SuSy和SPS基因在YB和SD比较中没有变化。对于这些基因是否参与萝卜肉质直根直径大小差异的调控还需进一步功能验证。

另外，据报道，光合同化产物的分配，除了蔗糖外，其分解产物己糖通过糖酵解途径为植物的生理活动也提供各种养分[25]。植物体内己糖必需经磷酸化后才能进入糖酵解途径，己糖激酶是催化己糖磷酸化的酶系统。研究表明木薯的块根形成过程中，膨大期己糖激酶的活性最高，而块根成熟期，己糖激酶的活性有所降低[29]；此外，MeHK2基因在木薯块根形成期表达量最高，表明该基因在块根膨大过程中起一定的作用[29]。本研究发现一个编码HK3基因的转录本(Rsa1.0_08050.1_g00001.1)在YB中上调表达。结果表明，HK3基因可能是影响‘扬州圆白’和‘萨丁’萝卜肉质直根直径大小差异的因子。

植物激素对贮藏根的发育和膨大具有重要作用[18,29]。本研究共鉴定到激素相关差异表达转录本29个，分别参与了生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸、乙烯、油菜素类固醇、茉莉酸和水杨酸等8条植物激素信号转导途径。生长素具有促进细胞分裂和分化以及细胞膨大的作用[30]，本研究发现参与生长素代谢途径的4个差异转录本均为SAUR基因，2个SAUR差异表达转录本(Rsa1.0_01909.1_g00006.1和Rsa1.0_00483.1_g00001.1)在YB中上调表达，2个(Rsa1.0_00019.1_g00012.1和Rsa1.0_00269.1_g00025.1)在YB中下调表达，暗示同一个SAUR基因家族不同成员在萝卜肉质根膨大过程中所起的作用不同。CTK诱导贮藏根形成时的细胞分裂，促进分生组织的扩大[31]，A-type ARR在抑制细胞分裂素反应中起重要作用[32]。笔者发现1个参与CTK代谢途径的A-ARR基因(Rsa1.0_05100.1_g00001.1)在YB中均上调表达，暗示了A-ARR基因不是引起2个萝卜根直径大小差异的主要因子，其具体功能有待进一步验证。JA通过促进碳水化合物代谢而引起贮藏根的形成[33]。TIFY家族中的JAZ亚家族蛋白是JA信号转导途径中的重要调控因子，可以启动JA应答基因的转录[34]。拟南芥中，过表达ZIM/AtTIFY1基因促进叶柄和下胚轴伸长[35]。本研究发现12个编码TIFY蛋白的差异转录本，属于JAZ亚家族基因，在YB中均表现为上调表达。其中，TIFY10B(Rsal.001963.1_g00004.1)在YB中特异性表达，暗示这个基因可能是‘扬州圆白’萝卜肉质直根的膨大关键因子。GA能够调控根细胞的膨大[36]，本研究发现GA信号通路中的负向调控因子DELLA蛋白在YB中下调表达。ETH刺激细胞延伸从而引起贮藏根膨大[37]，ERF与EREBPs可以与靶基因启动子上的GCCbox相互作用，从而激活ETH响应[38]。本研究发现1个ERF2基因在YB中均上调表达。BR提高萝卜可溶性蛋白质含量[39],也可以促进植物的生长和细胞的膨大，CYCD3是BR响应的下游组件，可以促进细胞分裂[40]。本研究发现1个CYCD3基因在YB中表现为显著上调表达；此外，据报道在拟南芥中BR通过增加AtXTH22基因(TCH4)表达量促进细胞扩展伸长[41]。本研究发现3个编码XTH22酶基因在YB中均表现为上调表达。以上结果推测，TIFYs、DELLA、ERF2、XTH22和CYCD3基因可能是引起YB和SD根直径大小差异的调控因子。以上所有基因在萝卜肉质根发育过程中的生理作用尚需进一步深入研究。

4 结 论

基于RNA-seq测序的数字基因表达谱技术，本研究共获得1 468个差异表达转录本。功能注释共鉴定28个差异转录本参与细胞壁代谢，2个差异转录本参与蔗糖代谢，29个差异转录本参与激素合成与信号转导。令人感兴趣的是，一些参与植物激素合成与激素信号转导相关基因(TIFYs、DELLA、ERF2和CYCD3)、蔗糖代谢相关基因(ATBETAFRUCT4和HK3)和细胞壁代谢相关基因(XTHs、EXPs和COBs)在‘扬州圆白’萝卜中上调表达，推测这些基因可能参与‘扬州圆白’和‘萨丁’萝卜肉质直根大小的差异的调控。同时利用RT-qPCR 对6个细胞壁代谢相关基因的表达模式进行了验证。这些结果将有助于对控制根大小相关基因的进一步功能分析，并为揭示萝卜肉质直根大小基因型间差异的分子机制提供依据。