不对称还原苯丙酮酸的L-乳酸脱氢酶L-LcLDH2的表达及生物信息学分析

李雪晴， 袁风娇， 刘 艳， 李剑芳， 邬敏辰

（1.江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122；2.江南大学 无锡医学院，江苏 无锡 214122）

手性α-羟基酸是合成许多药物、化学材料的重要前体物质[1-2]。例如，苯乳酸（Phenyllacticacid，PLA）又名2-羟基-3苯基丙酸，存在两种对映异构体，D-PLA和L-PLA。D/L-PLA均具有广谱且高效的抑菌活性，是一种新型天然生物防腐剂[3]，可作为饲料添加剂替代畜禽饲料的抗菌剂[4-5]。

L-乳酸脱氢酶（L-lactate dehydrogenase，L-LDH，EC 1.1.1.27），是脱氢酶中十分重要且研究较多的一种酶，也是生物体内糖酵解途径中一种关键的氧化还原酶。已有研究发现多种L-LDH可不对称还原苯丙酮酸（phenylpyruvic acid，PPA）生成 PLA，如嗜热脂肪地 芽孢杆菌 （Geobacillus stearothermophilus）的bsLDH[6]，副干酪乳杆菌（lactobacillus paracasei）的L-LDH[7]和凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）NL01的L-nLDH[8]等。但是不同的L-LDH不对称还原PPA的能力存在明显差异，如贾江花等[9]克隆了来源于植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）中的L1-LDH和L2-LDH基因，并在大肠杆菌（Escherichia coli）中实现了表达，重组L1-LDH对PPA的比活性为71.06 U/mg，而重组L2-LDH对PPA的比活性为0.06 U/mg。来源不同的L-LDH对PPA的活性差异更加明显，如王颖[10]等将来源于巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium Z2013513）L-LDH酶基因在E.coli中实现了表达，重组L-LDH粗酶液的酶活性仅为3.4 U/mg。因此，利用分子生物学手段不断挖掘出性状优良的L-LDH，仍然是目前研究发展的趋势。

本研究以干酪乳杆菌 （Lactobacillus casei CICIMB1192）基因组为模板，通过PCR扩增出一种编码 L-乳酸脱氢酶（L-LcLDH2）的基因 Lcldh2，并借助 pET-28a（+）将 Lcldh2 在 E.coli BL21（DE3）中实施异源表达。采用表达L-LcLDH2的E.coli/Lcldh2全细胞催化PPA，测定PLA的产量与对映体纯度。以PPA为底物，测定重组L-LcLDH2粗酶液的酶活性。最后，借助生物信息学软件分析L-LcLDH2的理化性质和功能特性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒、菌株和培养基 克隆质粒pUCm-T购自 Sangon上海公司；表达质粒 pET28a（+）、L.casei CICIMB1192、E.coli JM109 和 E.coli BL21（DE3）由作者所在实验室保藏；MRS培养基:酵母提取物5 g/L、蛋白胨10 g/L、葡萄糖20 g/L、硫酸锰 0.25 g/L、乙酸钠 5 g/L、硫酸镁 0.58 g/L、磷酸氢二钾 2 g/L、柠檬酸二铵2 g/L、吐温80 1 mL，调pH至6.2。LB液（固）体培养基:酵母提取物5 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L、20 g/L 琼脂粉。

1.1.2 主要试剂和仪器 rTaq DNA聚合酶、限制性内切酶、T4 DNA连接酶均购自TaKaRa大连公司；SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒、250 bp ladder marker和低相对分子质量protein marker购自Sangon上海公司；PPA购自Sigma-Aldrich美国公司；D/L-PLA和L-PLA购自安耐吉化学上海公司；NADH购自百灵威上海公司；其它试剂均为国产或进口分析纯。液相色谱仪Waters-2695和紫外检测器Waters-2489购自Waters美国公司；液相色谱柱ProntoSIL C18（150 mm×4.6 mm × 0.25 μm）购自德国Bischoff公司，手性液相色谱柱OD-H（250 mm×4.6 mm ×5 μm）购自大赛璐药物手性技术（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 搜索出NCBI公布的L.casei基因组中的L-LcLDH2氨基酸序列（KTE98134），根据其对应的核苷酸序列，设计一对扩增Lcldh2的特异性PCR引物，委托上海Sangon公司合成。

Ldh-F:5′-CATATGATGGCAAGAACAATTGG T-3′下划线部分为NdeⅠ酶切位点

Ldh-R:5′-CTCGAGCTTCATTTTTTCAAAGGT ATC-3′下划线部分为XhoⅠ酶切位点

1.2.2 L-LcLDH2基因的克隆 挑取L.casei CICIMB1192单菌落于5 mL MRS培养基中，37℃、220 r/min培养过夜，取1.4 mL菌液用于总DNA提取[11]。以此总DNA为模板，Ldh-F和Ldh-R为引物，进行PCR:94℃预变性4 min，30个循环 （94℃ 30 s、53 ℃ 30 s和 72 ℃ 60 s），72℃充分延伸 10 min。将纯化的目的PCR产物与pUCm-T连接获重组质粒pUCm-T-Lcldh2，转化E.coli JM109，蓝白斑筛选和DNA测序。将测序正确的重组质粒经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切，割胶回收Lcldh2，与经同样双酶切的pET-28a（+）连接，获重组表达质粒 pET-28a（+）-Lcldh2，转化 E.coli BL21（DE3），DNA 测序验证。

1.2.3 L-LcLDH2的诱导表达 测序正确的转化子命名为 E.coli/Lcldh2，而仅含 pET-28a（+）转化子命名为E.coli/pET-28a。分别挑取E.coli/Lcldh2和E.coli/pET-28a单菌落接种于2 mL含100 μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃、220 r/min过夜培养。以2 g/dL的接种量转接于新鲜的100mL LB培养基中，37℃培养至OD600nm约为0.6~0.8时，加入终浓度为0.4 mmol/L的IPTG溶液，16℃诱导10 h。8 000 r/min、5 min离心收集菌体，经磷酸钠盐缓冲液（Na2HPO4/NaH2PO4、100 mmol/L、pH 7.0）洗涤 2 次后制备含100 mg/mL湿细胞的菌悬液，用于SDS-PAGE电泳分析及后续研究。另取一定量含50 mg/mL湿细胞的菌悬液，超声破碎后，4℃，12 000 r/min，离心10 min后取上清液即为粗酶液。采用Bradford法[12]测定蛋白质含量。

1.2.4 L-LcLDH2酶活性的测定 L-LcLDH2的酶活性测定方法:总反应体系包括50 mmol/L乙酸钠缓冲液（pH 5.5），0.2 mmol/L NADH，5 mmol/L PPA，对照组中不含NADH，其他成分相同。混匀后于30℃保温5min，加入适量的酶液。检测NADH在340nm处吸收值的变化。酶活力单位（U）定义为:在上述条件下，每分钟催化氧化1 μmol NADH所需要的酶量。比活性定义为每毫克酶蛋白所含的酶活单位数（U/mg）。

1.2.5 全细胞转化PPA生成PLA 于1 mL离心管中加入300 μL菌悬液和250 μL磷酸钠缓冲液（pH 7.0），37 ℃保温 5 min，再依次加入 50 μL 葡萄糖（终浓度 50 mmol/L）和 400 μL PPA（终浓度 10 mmol/L），反应1 h后，取200 μL反应液加入800 μL甲醇终止反应，过0.22 μm有机滤膜。按照方法1.2.6进行HPLC分析；另取200 μL反应液，用1 mL乙酸乙酯进行萃取，上层有机相经无水硫酸钠干燥后过0.22 μm有机滤膜，按照方法1.2.6进行对映选择性分析。

1.2.6 HPLC分析PPA和PLA 采用反相HPLC分析PPA及PLA，色谱柱为ProntoSILC18（150 mm×4.6 mm×0.25 μm），分析条件:流动相为体积分数0.05%三氟乙酸/水 （A）和体积分数0.05% 三氟乙酸/甲醇（B）混合液，梯度洗脱程序为（体积分数）:0～15 min 20%～65%B；15～16 min 65%～100%B；16～19 min保持 100%B，紫外检测器，柱温 30℃，流速1 mL/min。检测波长为210 nm，PPA和PLA的保留时间依次为11.372 min，12.858 min。

采用正相HPLC进行手性分析[13]，色谱柱为Daicel OD-H（250 mm×4.6 mm×5 μm），分析条件:流动相为正己烷/异丙醇/三氟乙酸（98∶2∶0.05，体积比），紫外检测器，柱温30℃，流速1mL/min，检测波长为210 nm，D-PLA和L-PLA的保留时间依次为33.896 min，35.806 min。依据峰面积计算L-PLA的eep=[LPLA-D-PLA/（L-PLA+D-PLA）]× 100%。

1.2.7 L-LcLDH2的生物信息学分析 运用表1列出的软件和程序分析L-LcLDH2的理化性质和功能特性。

表1 序列分析工具Table 1 Tools applied for sequence analysis

2 结果与分析

2.1 L-LcLDH2编码基因Lcldh2的克隆

以L.casei基因组为模板，按1.2.2方法进行PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳分析。结果在1 000 bp下方出现一特异性条带，大小与预期基本相符（见图1）。将其克隆至pUCm-T获重组质粒pUCm-TLcldh2。DNA测序结果显示，Lcldh2开放阅读框长906 bp，编码301个氨基酸。Lcldh2与模板的同源性为99.45%，Lcldh2的核苷酸序列中第181位由模板对应的G变为A，其氨基酸序列中第61位点的氨基酸残基由模板对应的Val变为Ile。

图1 Lcldh2的PCR扩增Fig.1 PCR amplification of Lcldh2

2.2 L-LcLDH2的诱导表达

按1.2.4方法将E.coli/pET-28a和E.coli/Lcldh2进行了诱导表达。SDS-PAGE结果显示，诱导的E.coli/Lcldh2全细胞约在相对分子质量33.5×103（表观相对分子量）处有一明显的特异性蛋白质条带（图2，泳道2），而E.coli/pET-28a在此处无特异性蛋白质条带（图2，泳道1），表明Lcldh2在E.coli BL21（DE3）中成功实现了异源表达。表达产物L-LcLDH2的粗酶液催化PPA的酶活性为47 U/mg，显著高于来源于Bacillus megaterium Z2013513的重组 L-LDH 的酶活性（3.4 U/mg）[10]。

2.3 全细胞催化PPA生成L-PLA

按照1.2.6方法，测定了E.coli/Lcldh2和E.coli/pET-28a全细胞在1 h催化10 mmol/L PPA后生成PLA的浓度。在37℃、220 r/min条件下，10 mmol/L PPA经30 mg/mL E.coli/Lcldh2全细胞转化1 h后，生成3.5 mmol/L的PLA，底物摩尔转化率为35%，而不含Lcldh2的E.coli/pET-28a催化PPA生成PLA的浓度仅为0.07 mmol/L，即含Lcldh2的重组菌转化PPA生成PLA的量比宿主菌提高了49倍。产物的手性分析结果显示，L-PLA的eep＞99%，表明L-LcLDH2具有很高的对映选择性。

图2 重组E.coli全细胞的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis ofthe whole cellof recombinant E.coli

另外，反相液相检测结果分析表明，全细胞催化PPA生成L-PLA的同时产生了一定量的副产物，经质谱检测确定该副产物为苯丙氨酸（Phenylalanine，Phe）。 微生物代谢途径中 Phe可在转氨酶的作用下转化为PPA，该反应为可逆反应。因此在E.coli/Lcldh2全细胞催化PPA生成PLA的反应中，E.coli自身携有的转氨酶可转化少量的PPA生成Phe。

2.4 L-LcLDH2的生物信息学分析

2.4.1 L-LcLDH2的一级结构分析 按照1.2.7方法预测了L-LcLDH2的理化特性和功能特性，结果显示，L-LcLDH2的分子式为C1451H2296N388O447S8，理论相对分子质量为32 585，理论等电点为5.5，平均亲水系数为-0.117，表现出强亲水性，不稳定指数为11.87，是一种稳定蛋白质，位于细胞质，无信号肽和跨膜区域，由此推测L-LcLDH2是一种非分泌型、非跨膜蛋白，保留在细胞质中，直接参与物质代谢。

运用ClustalW2和ESPript 3.0对L-LcLDH2与4种不同的L-LDH进行了多序列比对及保守序列和催化活性位点的分析（图3）。L-LcLDH2与L.rhamnosus L-LDH，L.perolens L-HicLDH，L.composti L-HicLDH，L.confuses L-HicLDH的同源性分别为92%、64%、53%、43%。如图3所示，L-LcLDH2存在典型的NAD+结合位点序列（GXGXXG，X-任意氨基酸）。L-LcLDH2的底物识别位点为Thr223，催化活性位点为 Arg89、Asp148、Arg151和 His176。 另外，Asp34是NAD+结构域中决定L-LDH的辅酶为NADH而不是NADPH的关键氨基酸，因此，L-LcLDH2是一种 NADH依赖型L-LDH。

图3 L-LcLDH2与其他来源的L-LDHs的多序列比对和保守区域分析Fig.3 Alignment of multiple sequences and analysis of conserved motifs of L-LcLDH2 with other L-LDHs

2.4.2 L-LcLDH2的二级结构预测和三维结构的同源建模 运用SOPMA预测L-LcLDH2的二级结构显示，L-LcLDH2含有 40.2%的 α-螺旋，19.93%的延伸链，7.97%的β-转角和31.89%的无规则卷曲。运用SWISS-MODEL和PyMOL对L-LcLDH2的三维结构进行了同源建模和分析（图3）。在蛋白质数据库中搜索出了与L-LcLDH2同源性为43%的来源于融合乳杆菌（L.confuses）的L-2-羟异己酸脱氢酶（L-2-Hydroxyisocaproate Dehydrogenase，L-HicDH，PDB:1HYH）晶体结构。基于L-HicDH结构与功能的研究[14]，推测L-LcLDH2由α螺旋和β折叠形成的NAD结合结构域和催化结构域所构成。NAD结合结构域主要由6个β折叠和5个α螺旋组成，而催化结构域主要由6个β折叠和4个α螺旋组成。已有研究表明[15]，L-LcLDH2的催化活性位点高度保守，活性中心由 Arg89、Asp148、Arg151和 His176组成。当α-羰基酸与酶结合时，Arg151的胍基结合到底物的羧基形成一个稳定的盐桥[16]，Arg89的胍基和His176的咪唑基共同与底物的α-羰基结合，其中His176提供质子，而Asp148稳定去质子化的His176，这些位点共同催化α-羰基酸上的α-羰基还原成羟基生成α-羟基酸[6]。

3 结 语

L-LDH在生物催化过程中具有重要的应用价值，通过基因工程实现L-LDH异源高效表达是降低其工业应用成本、适应工业应用的有效手段[17]。本研究从L.casei CICIMB1192基因组中成功克隆了一种编码L-LcLDH2的基因Lcldh2并实现了该基因在 E.coli BL21（DE3）中的异源表达，L-LcLDH2 的催化活性位点为 Arg89、Asp148、Arg151和 His176，具有典型NAD+结合位点序列，是一种NAD依赖型LLDH。采用E.coli/Lcldh2全细胞不对称还原PPA，可生成高光学纯度L-PLA。本研究为生物催化法制备手性L-PLA提供了新的工具酶，也为进一步利用该酶生产L-PLA提供了理论支持。

图4 L-LcLDH2的三维结构和催化活性位点Fig.4 Three-dimensional structure and catalytic sitesof L-LcLDH2