索氏提取与水蒸气蒸馏提取对丁香油抗氧化及抑制LDL氧化能力的影响

李学进 熊一凡,2 郑昌鸿 杨莉萍陈 慧 刘常金,2,3 江慎华,2,3

(1. 九江学院医学部，江西 九江 332000；2. 九江安德和生物科技有限公司，江西 九江 332000； 3. 天津科技大学食品工程与生物技术学院食品营养与安全国家重点实验室，天津 300457)

丁香是桃金娘科药用植物丁香 (EugeniacaryophyllataThunb.) 的干燥花蕾[1-2]，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、消炎和抗癌等特性[3]。丁香的主要化学成分分为两类：非挥发性成分和挥发性成分。非挥发性成分主要包括鞣质、多酚、黄酮类化合物等[4]。挥发性成分以丁香油为主，其含量高达21.3%[5]，具有很强的抗菌、抗氧化活性[6]。

植物油脂的提取方式较多，如水蒸气蒸馏提取法、超临界二氧化碳萃取法、压榨提取法、索式提取法等[3,7]。其中，水蒸气蒸馏法和索式提取法是实验室最普遍使用的2种方法。Hadi[5]使用正己烷和苯对丁香花蕾中的油进行索式提取；Guan等[8]优化了超临界二氧化碳萃取丁香精油的提取工艺，并与水蒸气蒸馏法、索式提取法等方法提取得到的丁香油组成成分进行了比较与分析。虽然国内外学者[5,8-9]采用这2种方法对丁香油进行了提取，但是，在这2种常用的提取方法中，究竟哪种方法提取效果更好，哪种方法提取所得丁香油脂的抗氧化活性及抑制LDL氧化效果更好，目前尚不清楚。因此，本试验拟分别采用水蒸气蒸馏法和索式提取法提取丁香油，进而对这2种丁香油脂抗氧化能力、抑制LDL氧化能力及抗氧化物质含量进行了比较，确定丁香油更优的提取方法，以期为后续丁香油脂产业化开发提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂

丁香：产自中国广西，江西樟树天齐堂中药饮片有限公司，粉碎过60目筛后冷藏备用；

LDL：采用刘仁绿等[10]的方法自血浆中分离得到，以牛血清白蛋白为标准品，采用Lowry法[11]测定蛋白浓度来定量LDL浓度；

肝素钠：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

其他化学试剂为分析纯或优级纯。

1.2 主要仪器设备

荧光磷光分光光度计：LS-55型，美国Perkin Elmer公司；

pH计：PB-10型，赛多利斯科学仪器有限公司；

紫外可见分光光度计(双光束)：TU-1901型，北京谱析通用仪器有限责任公司；

可见分光光度计：UNIC 7200 型，尤尼柯(上海)仪器有限公司；

高速万能粉碎机：DFY-300型，温岭市林大机械有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 丁香油提取

(1) 水蒸气蒸馏法：参考岳晓霞等[12]的方法，略作修改。称取丁香粉末50 g，加入到1 000 mL圆底烧瓶中，加700 mL蒸馏水，沸腾后开始计时，水蒸气蒸馏提取6 h，采用石油醚从收集液中萃取出丁香油，用无水硫酸钠干燥后获得水蒸气蒸馏丁香油 (clove oils extracted by steam distillation，COESD)，称重，按式(1)计算得率。

(1)

式中：

c——得率，%；

v1——水蒸气蒸馏丁香油容积，mL；

v2——提取液容积，mL。

(2) 索式提取法：在Li等[13]的方法基础上，略作修改。称取丁香粉末50 g，用滤纸包裹严实后置索氏提取器中，加400 mL石油醚于1 000 mL圆底烧瓶中，采用索式提取法提取6 h，沸腾后开始计算时间，蒸干石油醚得到丁香油，无水硫酸钠干燥后获得索式提取丁香油 (clove oils extracted by soxhelt methods，COESM)，称重，按式(2)计算得率。

(2)

式中：

c——得率，%；

v1——索式提取丁香油容积，mL；

v2——提取液容积，mL。

1.3.2 COESD及COESM抗氧化能力的比较 将COESD及COESM配制成相应浓度，空白对照组用甲醇代替丁香油，阳性对照以相同浓度VC和2,6-二叔丁基对甲酚 (2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol，BHT)代替丁香油样液，进行相同操作。分别对样品清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH)自由基能力、总抗氧化能力、总还原力和铁离子还原/抗氧化能力(Ferric reducing ability of plasma，FRAP)进行测定，以比较和评价这2种方法对丁香油的提取得率及其抗氧化及抑制LDL氧化功能活性的影响。

(1) DPPH自由基清除能力：采用江慎华等[14]的方法，略作修改。取0.5 mL不同浓度样液(6.250 0，12.500 0，25.000 0 μg/mL)同0.100 mmol/L DPPH溶液1.0 mL(现用现配)混合均匀，在30 ℃水浴中反应60 min，在517 nm 波长下测吸光值，以甲醇代替样液调零，操作中避光。空白对照组以同等体积甲醇代替样液执行相同操作。阳性对照组分别用相同浓度VC和BHT代替样液执行相同操作，清除率越高、抗氧化能力越强。DPPH自由基清除率按式(3)计算：

(3)

式中：

Y——抑制率，%；

A——空白对照样517 nm吸光值；

B——不同浓度样品517 nm吸光值。

(2) 总还原力：采用江慎华等[14]的方法，稍有修改。量取不同浓度样液(50.000，100.000，200.000 μg/mL)0.500 mL 加入试管中，依次加入1.250 mL pH 6.6磷酸缓冲液(0.200 mol/L)和1.250 mL铁氰化钾溶液(1%)，50 ℃水浴20 min后迅速冷却，再依次加入10%三氯乙酸溶液1.250 mL、蒸馏水4.25 mL、0.1%三氯化铁溶液0.85 mL，振荡均匀后静置10 min，在700 nm下比色测定，吸光值越高、抗氧化能力越强。

(3) 总抗氧化能力：采用江慎华等[14]的方法，略作修改。取不同浓度样液(100，150，200 μg/mL)加入试管中，再加终浓度0.600 mol/L硫酸、28.000 mmol/L磷酸钠和4.000 mmol/L钼酸铵混合液4 mL，振荡均匀后于95 ℃水浴加热90 min，取出后冷却至室温，在695 nm处测吸光值。

(4) FRAP法抗氧化能力：采用刘梦莹等[15]的方法略作修改。取100 μL不同浓度(12.5，25.0，50.0 μg/mL)样液与FRAP混合液振荡均匀，37 ℃反应40 min后，在波长593 nm测吸光值。FRAP混合液配制方法：将pH 3.6 乙酸钠缓冲液(0.300 mol/L)、10.000 mmol/L TPTZ溶液和20.000 mmol/L三氯化铁按体积比10∶1∶1混匀，现用现配。TPTZ溶液采用40.000 mmol/L 优级纯HCl为溶剂溶解、定容。

1.3.3 抑制LDL氧化修饰能力

(1) LDL氧化修饰孵育：LDL氧化修饰孵育体系参考文献[16](LDL及各种试剂浓度均为混合体系中的终浓度)。丁香油样品组：取4.9 mL LDL溶液(500 μg/mL)加CuSO4·5H2O溶液(1.25 μmol/L)50 μL，分别加50 μL、1 μg/mL不同样品，37 ℃恒温孵育48 h后测定以下指标以比较2种油对LDL氧化修饰的抑制效果。

(2) 阻止LDL氧化修饰过程中色氨酸(Trp)荧光淬灭：采用Chen等[17]方法，按1.3.3(1)方法孵育，在激发波长(Ex)295 nm /发射波长(Em)330 nm处测定荧光强度以比较抑制效果。

(3) 阻止LDL氧化修饰产生脂褐素能力：采用Yang等[18]方法，按1.3.3(1)方法孵育，在Ex 350 nm /Em 460 nm 处测定荧光强度以比较抑制效果。

(4) 阻止LDL氧化修饰产生总荧光产物：采用Cominacini等[19]的方法。按1.3.3(1)方法孵育，在Ex 360 nm/Em 430 nm 处测定荧光强度以比较抑制效果。

(5) LDL脂质氧化产物修饰赖氨酸(Lys)残基荧光变化：采用Picard等[20]的方法。按1.3.3(1)方法孵育，在Ex 390 nm/ Em (410～550) nm内扫描，测定荧光光谱以比较抑制效果。

(6) 通过紫外、可见全波长扫描比较抑制效果：采用Esterbauer等[21]的方法，略作修改。按1.3.3(1)方法孵育反应体系，在波长200～750 nm内扫描以反映抑制效果差别。

1.3.4 COESD及COESM抗氧化有效成分含量的比较

(1) 总多酚含量：采用江慎华等[22]和熊一凡等[16]的方法，略作修改。将Folin试剂原液用水稀释10倍，配制标准品没食子酸浓度分别为150.000，100.000，50.000，25.000，12.500，6.250，3.125，0.000 μg/mL 8个样液。取稀释后的Folin试剂2.250 mL，加入0.5 mL不同浓度没食子酸和100.000 μg/mL 2种丁香油，然后加入6% Na2CO3溶液2.25 mL、振荡均匀，在35 ℃水浴中孵育90 min 后于765 nm读数，根据浓度与吸光度值之间的相关性，确定标准曲线方程为：Y=0.012 4X-0.015 (R2=0.998 8)。

以丁香油代替没食子酸执行相同操作测定其总多酚含量。

(2) 总黄酮含量：采用江慎华等[22]的方法，略作修改。将标准芦丁配成质量浓度分别为1 000.000，800.000，600.000，400.000，200.000，100.000，50.000，0.000 μg/mL 8个样液。取去离子水2.25 mL加入0.5 mL 不同质量浓度的标准品芦丁溶液和4 000.000 μg/mL 2种丁香油，然后加入10%AlCl3·6H2O溶液0.3 mL，振荡均匀、静置5 min 后，加1.000 mol/L NaOH溶液1.000 mL，振荡均匀后在510 nm读数，确定标准曲线方程为：Y=0.001 1X-0.021 (R2=0.999 3)。

以丁香油代替芦丁执行相同操作测定总黄酮含量。

1.3.5 数据处理 采用 DPS 7.05进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 COESD及COESM得率的比较

由图1、2可见，COESD外观色泽清亮、透明，得率为17.79%。而COESM外观色泽为棕褐色，得率为20.30%。可能是石油醚在提取油脂的同时将原料中其它杂质及色素等成分也溶解出来[8]。Guan等[8]在提取丁香油时也发现COESD的得率低于COESM，且COESM色泽为棕褐色。

2.2 COESD及COESM抗氧化能力的比较

2.2.1 DPPH自由基清除能力的比较 由图3可见，COESD和COESM清除率随着浓度增加而增强，呈现出良好的量效关系。其中，COESD的清除率均高于COESM的(P<0.01或P<0.05)。当浓度升高到25.000 μg/mL时，COESD的清除率高达 (83.520±0.100)%，显著高于COESM (81.278±0.057)%(P<0.01)。2种丁香油清除率均显著高于阳性对照BHT (P<0.01)，均呈现出很强的清除能力。庄军辉等[23]发现丁香油主要成分丁香酚中含有酚羟基，容易释放·H，并与DPPH·配对，所以丁香油对DPPH自由基呈现出很强的清除能力。

图1 COESD、COESM外观色泽Figure 1 The colours of COESD and COESM

图2 COESD、COESM得率Figure 2 The yields of COESD and COESM

不同大写字母表示浓度分别在6.25，25.00 μg/mL不同样品的清除能力具有极显著性差异(P<0.01)；不同小写字母表示浓度在12.5 μg/mL不同样品之间的清除能力具有显著性差异(P<0.05)

图3 对DPPH自由基清除能力比较

Figure 3 The comparison of scavenging ability on DPPH radicals

2.2.2 总还原力的比较 由图4(a)可得出，在50.000～200 μg/mL时，COESD与COESM呈现出很高的总抗氧化力，均强于阳性对照BHT(P<0.05或P<0.01)；COESD总抗氧化力显著高于COESM(P<0.05或P<0.01)，显示出与2.2.1相同的比较结果。当浓度为50.000 μg/mL 时，COESD在700 nm吸光值 (0.296±0.003)甚至显著高于VC的(0.289±0.002)(P<0.05)。当浓度为200.000 μg/mL时，COESD吸光值 (0.952±0.006)比COESM (0.848±0.009)高出0.104，并产生显著性差异(P<0.01)。这可能是COESD所含还原酮高于COESM中还原酮的缘故[24]。

不同大写字母表示浓度在200 μg/mL不同样品之间的总还原能力具有极显著性差异(P<0.01)；不同小写字母表示浓度分别在50，100 μg/mL不同样品之间的总还原能力具有显著性差异(P<0.05)

图4 总还原力比较

Figure 4 The Comparison of total reducing powers

从图4(b)可看出，4种样品浓度与总还原力之间具有良好的线性关系，R2均高于0.99以上，VC样品的相关系数R2高达1.0，本试验测定结果的可靠性得到了验证。赵楠楠等[25]在研究红松壳抗氧化能力时也发现其样品浓度与OD700吸光度值显示出高度相关，R2达0.989，与本研究结果相似。

2.2.3 总抗氧化能力的比较 由图5(a)可知，COESD和COESM吸光值均极显著高于阳性对照BHT和VC(P<0.01)，说明这2种丁香油均呈现出非常强的总抗氧化活性(OD695值越高总抗氧化能力越强)。COESD各浓度吸光值均极显著高于COESM (P<0.01)。当浓度为200.000 μg/mL 时，COESD吸光值高达 (1.424±0.009)，比COESM吸光值(1.304±0.010)高出9.2%。

图5(b)中显示出各样品浓度与总抗氧化力也呈现出良好的线性关系，R2均高于0.98以上，COESM样品的相关系数R2高达1.0，也验证了本试验测定结果的可靠性。郭娟等[26]在研究芦丁和丹参素的抗氧化能力时也发现其样品浓度在OD695吸光度值呈现出良好的浓度依赖性，得出与本研究相似的结果。

不同大写字母表示浓度分别在100，150，200 μg/mL不同样品之间的总抗氧化能力具有极显著性差异(P<0.01)

图5 总抗氧化能力比较

Figure 5 The Comparison of total antioxidant activity

2.2.4 FRAP法抗氧化能力的比较 从图6(a)可得，其结果与总抗氧化能力相似，浓度在12.5～50.0 μg/mL时，COESD及COESM显示出非常强的抗氧化力，OD593吸光度值均显著高于两个阳性对照VC和BHT。2种丁香油相比，COESD的OD593比COESM更高(P<0.01)。由图6(b)可知，各样品浓度与OD593吸光度值也显示出良好的线性关系，R2均>0.98，验证了试验结果的可靠性。Olszowy等[27]在研究不同精油的FRAP抗氧化能力时也发现样品浓度与OD593吸光度值显示出高度相关，R2均为0.8～1.0。

2.3 COESD及COESM抑制LDL氧化能力的比较

LDL氧化是引起AS的关键环节[28]。天然抗氧化剂在抑制LDL氧化、预防AS和相关心血管疾病中具有重要意义[29]。上述试验结果证明，在2种提取方法所得丁香油中，COESD的抗氧化能力比COESM更强。以Trp荧光淬灭、脂褐素荧光定量、总荧光产物、Lys残基荧光变化和全波长扫描为评价指标，进一步对COESD及COESM抑制LDL氧化能力进行比较和评价。

2.3.1 对LDL氧化过程中Trp残基荧光淬灭效果的比较 如图7所示，添加丁香油及BHT后，Trp残基荧光淬灭得到显著抑制(P<0.05)。COESD的Trp残基荧光强度 (135.638)高于COESM的 (133.155)，与BHT样液荧光强度 (136.105)无显著差异。这可能是丁香油中抗氧化成分通过阻止apoB-100中Trp残基的氧化而实现对LDL氧化的抑制。熊一凡等[16]也发现丁香总多酚提取物对LDL氧化过程中Trp残基荧光淬灭具有很好的抑制效果。

不同大写字母表示浓度分别在12.5，25.0，50.0 μg/mL不同样品之间的FRAP抗氧化能力具有极显著性差异(P<0.01)

图6 FRAP法抗氧化能力的比较

Figure 6 The Comparison of FRAP antioxidant activity

不同小写字母表示不同样品之间Trp残基产生的荧光强度具有显著性差异(P<0.05)

图7 对LDL氧化过程中Trp荧光淬灭的抑制比较

Figure 7 The comparison of inhibition efficiency on Trp fluorescence quenching

2.3.2 对LDL氧化过程中脂褐素产生抑制效果的比较

从图8中可以看出，空白组荧光强度最低，促氧组的荧光强度最高，说明LDL氧化修饰过程中产生较多量脂褐素。在丁香油及阳性对照样中，BHT组脂褐素产生量最多(荧光强度为132.739)，其次是COESM(荧光强度为130.787)，COESD产生量最少(荧光强度为124.975)。说明添加丁香油或BHT能显著减少脂褐素产生，对LDL氧化修饰具有显著的抑制效果，显示COESD及COESM中抗氧化成分通过保护LDL中蛋白、阻碍脂质氧化产物与蛋白结合形成脂褐素，从而抑制LDL氧化[2]。

不同大写字母表示不同样品之间脂褐素产生量具有极显著性差异(P<0.01)

图8 对LDL氧化修饰过程中脂褐素生成的抑制比较

Figure 8 The comparison of inhibition efficiency on lipofuscin generation during oxidation of LDL

2.3.3 对LDL氧化过程中总荧光产生的抑制比较 由图9可得，促氧组荧光强度最高，说明没有样液保护的LDL氧化最快，空白组荧光强度最低。添加丁香油及BHT样液后总荧光的产生得到有效抑制。COESD及COESM的总荧光均显著低于阳性对照BHT，显示出很强的抑制效果。其中，COESD总荧光强度仅为170.967，显著低于COESM样液的 (179.991) (P<0.01)，均弱于阳性对照BHT，可知丁香油能有效地抑制总荧光产物的产生。COESM (179.991)荧光强度强于COESD (170.967) (P<0.01)，说明COESD抑制总荧光产物生成的能力更强。王丽丽等[30]也发现，紫丁香叶提取物也能有效抑制脂褐素等荧光产物的产生。

不同大写字母表示不同样品之间总荧光产物产生量具有极显著性差异(P<0.01)

图9 对LDL氧化修饰过程中总荧光产物生成的抑制比较

Figure 9 THe comparison of inhibition effects on fluorescent products generation during oxidation of LDL

2.3.4 对LDL脂质氧化产物修饰Lys残基荧光变化的抑制效果比较 由图10可知，在410～550 nm时，促氧组氧化修饰程度最严重，其荧光强度最强，明显高于空白组及各样品组。添加COESD、COESM及BHT样液后荧光强度均显著下降，表明这些样品能有效抑制MDA氧化修饰Lys残基。尽管COESM的抑制效果不及COESD，但这2种丁香油的抑制效果均强于BHT。原因可能是丁香油中抗氧化成分能竞争性抑制MDA与Lys残基交联形成MDA-Lys，从而抑制LDL氧化[18]。

2.3.5 通过紫外、可见光全波长范围内扫描对COESD及COESM抑制LDL氧化修饰效果的比较 从图11看出，促氧组在249 nm处有最高峰，与空白组相比，其吸光值上升迅速，且最大吸收峰明显发生红移。谢志勇等[31]发现，LDL氧化修饰过程中形成共轭二烯 (CD)，并产生新的发色团，使最大吸收峰明显发生红移，而添加COESD和COESM样液后，最大吸收峰均低于促氧组，且能有效抑制光谱红移。其中，COESD抑制效果较COESM更胜一筹。Yang等[18]也发现丁香乙酸乙酯相能有效抑制LDL氧化过程中CD在234 nm形成的吸收峰红移。

图10 LDL氧化修饰过程中MDA修饰Lys残基的抑制效果

Figure 10 The comparison of inhibition efficiency on Lys residue being modified by MDA during oxidation of LDL

图11 对LDL氧化过程中紫外可见光谱改变的的抑制效果比较

Figure 11 The comparison of inhibition efficiency on on UV-Visible spectroscopy during oxidation of LDL

上述结果表明，在LDL氧化过程中，各样品对Trp残基荧光淬灭、对脂褐素及总荧光产物产生的抑制效果、对MDA修饰Lys残基及对紫外可见光谱改变的抑制效果排列顺序依次为：COESD>COESM>BHT。

2.4 COESD及COESM总多酚、总黄酮含量的比较

总多酚、总黄酮为植物油中主要的抗氧化物质[32]。COESD抗氧化活性及对LDL氧化修饰的抑制能力均强于COESM。为进一步分析其中的原因，本试验进一步对这2种丁香油所含的抗氧化活性主要物质——总多酚及总黄酮含量进行了测定，测定结果如图11、12所示。

通过图12、13可知，COESD中总多酚含量显著高于COESM (P<0.01)；而尽管COESD总黄酮含量也比COESM高，但却无显著性差异。据文献报道，丁香油中主要成分为丁香酚[9]。总多酚、总黄酮测定结果表明，COESD抗氧化能力及抑制LDL氧化能力均比COESM更强的原因很可能是其含有更高含量的总多酚、总黄酮。

不同大写字母表示不同样品之间总多酚含量具有极显著性差异(P<0.01)

图12 总多酚含量比较

Figure 12 The Comparison of total polyphenols

图13 总黄酮含量比较Figure 13 The Comparison of total flavonoids

3 结论

本试验采用水蒸气蒸馏和索式提取这2种最常用的方法提取得到水蒸气蒸馏丁香油(COESD)和索式提取丁香油(COESM)，然后对COESD和COESM得率、外观、抗氧化及抑制LDL氧化能力进行了比较。结果发现，COESD外观色泽清亮、透明，得率为17.79%，COESM外观色泽为棕褐色，得率为20.30%；尽管COESD得率稍低于COESM，但COESD抗氧化能力(DPPH自由基清除率、总还原力、总抗氧化能力及FRAP法抗氧化能力)却高于COESM(P<0.05或P<0.01)；COESD对LDL氧化的抑制能力(Trp荧光淬灭、脂褐素及总荧光产生量、MDA修饰Lys残基荧光变化和全波长扫描比较)也强于COESM；通过进一步测定组成成分发现，COESD抗氧化及抑制LDL氧化能力更强的主要原因是含有更多量的总多酚及总黄酮。由此可见，COESD油的品质好于COESM，但是其得率偏低是该技术的限制因素。后续应进一步提高COESD得率以及比较这两种技术的经济成本；采用其它提取技术所得丁香油抗氧化及抑制LDL氧化能力如何，COESD与COESM所含抗氧化成分的差别及脂肪酸组成也有待继续探索。