丁酸梭菌与酪丁酸梭菌发酵特性比较

王友玲 魏竹君 刘 青朱立磊 肖海芳 宋元达

(1. 山东理工大学农业工程与食品科学学院，山东 淄博 255000；2. 山东玉兔食品有限公司，山东 淄博 255300)

丁酸是一种重要的短链脂肪酸，由结肠益生菌发酵不易消化的糖类产生。据大量的研究[1-3]发现，丁酸具有多重生理功能，可为结肠细胞生长供能，维持肠道菌群稳态和抑制肠道炎症、癌症发生等。其抑制肿瘤的首要机制是作为一种去乙酰化酶(histone deacetylase)的抑制剂，主要通过改变组蛋白的乙酰化程度来改变染色质结构，参与多种基因的表达，从而抑制多种肿瘤细胞生长，诱导细胞成熟分化，诱导癌细胞凋亡[4]。

丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)是人体正常的肠道细菌，革兰氏阳性厌氧菌，其发酵产物以丁酸和乳酸为主，副产物还有乙酸、丁醇、淀粉酶、脂肪酶和维生素等[5]。由于是发酵产物，丁酸梭菌具有极强的整肠作用，可用于治疗肠道菌群紊乱、急慢性腹泻、肠易激综合征等，其微生物制剂已在临床得以广泛应用[6]。目前发现的丁酸梭菌主要是由多种来源分离纯化而得到的野生型菌株，如牲畜粪便[7]、河畔污泥[8]、朗姆酒发酵液[9]等。

酪丁酸梭菌(Clostridiumtyroburicum)是一种典型的产丁酸微生物[10-11]，属于有机化能异养型专性厌氧菌，革兰氏阳性芽孢杆菌酪丁酸梭菌不能水解明胶、血清蛋白，可以发酵葡萄糖、蔗糖、果糖和乳糖，并产生丁酸、乳酸、丙酸和乙酸等短链脂肪酸[12]。Luo等[13]研究了木糖、葡萄糖为碳源时丁酸的产量，结果发现酪丁酸梭菌更偏好葡萄糖为碳源。Jiang等[14]利用纤维床固定化酪丁酸梭菌发酵葡萄糖，丁酸得率达到0.46 g/L。

丁酸梭菌和酪丁酸梭菌作为产丁酸的代表性菌株，其各自的发酵特性和生物活性已被广泛研究。刘磊等[15]研究发现丁酸梭菌CBM01最佳碳源和最佳氮源分别是葡糖糖和蛋白胨；邢宏观等[16]采用响应面法对丁酸梭菌生物量的发酵工艺进行优化，优化后菌体数达到1.01×109个/mL；吴杰等[17]发现丁酸梭菌对健康大鼠生长没有负面影响，对脂多糖导致的肠道蔗糖酶活性降低起到抑制作用；Liu[18]利用基因工程技术构建了酪丁酸梭菌磷酸转乙酰酶缺失体，产酸量提高到0.4 g/g；Song等[19]以褐藻为碳源，采用分批发酵和半连续发酵，丁酸产率为0.252 g/g。由此看来对丁酸梭菌的研究大多集中于加大其生物量及其在动物饲料上的运用，而到目前为止尚未发现对丁酸梭菌和酪丁酸梭菌产丁酸量的比较研究。本研究拟以不同来源的丁酸梭菌和酪丁酸梭菌为出发菌株，比较它们在同一合成培养基中的发酵特性和产酸能力，旨在揭示不同属产丁酸菌的差异，为后期研究产丁酸菌株在代谢途径上的差异提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料

ClostridiumbutyricumNK：分离于山东理工大学志愿者粪便；

ClostridiumbutyricumSY：分离于山东扳倒井股份有限公司酒窖窖泥；

ClostridiumbutyricumRX：分离于桓台县马桥镇汇源养牛场鲁西黄牛肠道内容物；

ClostridiumtyrobutyricumATCC25755：中国普通微生物菌种保藏管理中心。

1.1.2 试剂

快捷型提取DNA试剂盒：山东赛恩斯科技有限公司；

葡萄糖：分析纯，阿拉丁试剂(上海)有限公司；

丁酸：色谱纯，国药集团化学试剂有限公司；

3.5-二硝基水杨酸：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

二氯甲烷：色谱纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3 仪器与设备

离心机：5038R型，德国Eppendorf公司；

电泳仪：DYY-6D型，北京市六一仪器厂；

pH计：FE20型，梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司；

紫外分光光度计：UV-2600型，日本岛津公司；

气相色谱仪：6980N型，美国安捷伦公司。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基

(1) 筛选培养基：葡萄糖8 g，胰蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，pH(7.0±0.1)，121 ℃灭菌20 min。

(2) 种子培养基：酵母膏3 g，牛肉膏10 g，蛋白胨10 g，可溶性淀粉1 g，葡萄糖5 g，氯化钠3 g，乙酸钠3 g，琼脂15 g，刃天青3 mg，半胱氨酸盐酸盐0.5 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0±0.1，121 ℃灭菌20 min。

(3) 合成发酵培养基：葡萄糖30 g，蛋白胨5 g，酵母膏5 g，硫酸铵3 g，硫酸镁0.3 g，磷酸二氢钾1 g，刃天青3 mg，半胱氨酸盐酸盐0.5 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0±0.1，121 ℃灭菌20 min。

1.2.2 菌种的分离纯化 参考文献[8]方法分离纯化菌种，分别称取1 g粪便、窖泥和动物肠道内容物装入9 mL无菌无氧的厌氧管中。充分振荡后，在无氧条件下采用10倍梯度稀释法制成为10-2，10-3，10-4，10-5稀释液，分别取0.1 mL涂布在固体筛选培养基，37 ℃厌氧培养48 h。培养基长出的单菌落进行镜检，对符合梭状芽孢杆菌特征的单菌落划线、接种到新鲜固体筛选培养基上，37 ℃ 厌氧培养48 h，重复上述操作2次。获取单菌落种子培养基悬液培养，分别进行16S rDNA基因系列分析，直到获得丁酸梭菌菌株。

1.2.3 16S rDNA基因系列分析 按照文献[20]提取细菌基因组DNA，对获得的总基因组DNA进行16S rDNA的PCR扩增，采用通用引物：27F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，1492R：5′-TACGGYTACCTTGTTA-CGACTT-3，，扩增条件：预变性95 ℃ 5 min，变性95 ℃ 30 s；退火47 ℃ 2 min；35cycle；72 ℃ 10 min。将PCR扩增片段回收，送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。将测序结果与NCBI数据库对比，绘制发育树，确定菌株在系统分类学上的归属菌株。

1.2.4 菌株生长特性及发酵培养 将活化的筛选菌株NK，SY，RX及酪丁酸梭菌ATCC25755菌液按2%接种于液体种子培养基中，于37 ℃恒温静置培养，每2 h 取样1次，在波长600 nm处测菌液吸光度值(OD600)，绘制菌株生长曲线。

将活化的菌株NK，SY，RX及酪丁酸梭菌ATCC25755菌液按2%接种于液体种子培养基中，待其长至对数生长期以3%的接种量接种于200 mL合成发酵培养基，37 ℃静置培养。发酵过程中定时取样测定菌体生物量、发酵液中还原糖含量、以及乳酸、丁酸的含量。

1.3 发酵特性指标测定

1.3.1 生物量 采用分光光度法测定发酵液在600 nm处的吸光值。

1.3.2 pH值 采用pH计测定。

1.3.3 还原糖 采用3，5-二硝基水杨酸法[21]。

1.3.4 丁酸和乳酸 采用气相色谱分析[22]，发酵液经离心后取上清液2 mL于提取瓶中，加入12.5%的硫酸—甲醇溶液1 mL，混匀，60 ℃水浴加热6 h，自然冷却至室温，加入2 mL二氯甲烷，充分振荡使其混匀，静置分层后，取下层溶液转移到新的提取瓶中，重复萃取3次。合并萃取液并加入饱和NaCl溶液1.5 mL洗涤，4 000 r/min离心5 min后，取下层溶液进行气相分析。气相分析条件：FID检测器，DB-FFAP毛细管柱(60 m×0.32 mm×0.25 μm)，进样口温度260 ℃，检测器温度250 ℃。升温程序为100 ℃保持1 min，再以3 ℃/min升温至160 ℃，然后以10 ℃/min升温至240 ℃，并保持5 min；进样量为1 μL，载气为氮气。

分别配制不同浓度的标准溶液，按上述处理后作标准曲线。

1.3.5 数据处理 所有试验均重复3次取平均值。采用Excel 2003对试验数据进行分析，采用Origin 7.5 作图。

2 结果与分析

2.1 16S rDNA基因序列分析

2.1.1 菌株NK、SY、RX 16S rDNA基因片段PCR产物扩增 16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA系列，在结构与功能上具有高度保守性，而且大小在1.5 kb左右，容易利用PCR技术得到其序列。由图1可以看出，菌株NK、SY、RX的PCR扩增产物大小在1.5 kb左右，说明是其16S rDNA扩增产物。

1. 菌株NK 2. 菌株SY 3. 菌株RX

2.1.2 菌株NK、SY、RX 16S rDNA基因序列及进化发育树 经测定，菌株NK、SY、RX的16S rDNA基因序列长度分别为1 415，1 416，1 412 bp。使用DNAstar分析3株菌株的A、G、T和C比例如图2所示，其A+T所占比例分别为47.70%，47.74%，47.66%，因它们是同一属种，所以相似度很高。酪丁酸梭菌ATCC25755菌种的A+T所占比例为47.46%，与以上菌株相比，有较大差异。

图2 菌株NK、SY、RX、酪丁酸梭菌ATCC 25755

Figure 2 A, G, C and T ratio of 16S rDNA sequence in strain NK SY RX andClostridiumtyrobutyricumATCC25755

菌株NK、SY、RX 16S rDNA核苷酸序列在National Center Biotechnology Information 使用BLASTN程序进行比对。结果显示菌株NK、SY、RX 16S rDNA核苷酸序列分别和ClostridiumbutyricumW4，ClostridiumbutyricumB1，ClostridiumbutyricumDSM2477的核苷酸序列同源性为99%。用MEGA软件构建系统发育树见图3，菌株NK、SY、RX在Clostridium属发育树一个分支上，与Clostridiumbutyricum种的菌种在一个类群内而与其他种处于不同的分支上，所以把它们分别命名为ClostridiumbutyricumNK、ClostridiumbutyricumSY、ClostridiumbutyricumRX。

2.1.3 丁酸梭菌和酪丁酸梭菌的生长曲线 如图4可见，各菌株在种子培养基中生长良好，丁酸梭菌NK和丁酸梭菌SY的对数生长期为4～12 h，所以确定种子菌液接入发酵培养基的时间点为8 h，同理，丁酸梭菌RX和酪丁酸梭菌ATCC25755菌液接入时间点确定为12 h。

2.2 丁酸梭菌和酪丁酸梭菌在合成培养基中的发酵特性比较

2.2.1 生物量的变化 随发酵进行，菌体生物量变化如图5所示。丁酸梭菌NK和丁酸梭菌SY具有良好的生长性能，生长速率较丁酸梭菌RX和酪丁酸梭菌ATCC25755大，在0～16 h内迅速达到生长稳定期，OD600分别为7.09和6.44。而丁酸梭菌RX和酪丁酸梭菌ATCC25755生长速率较小，在16 h时仅分别为3.80和3.16，并且稳定期菌体细胞浓度也比丁酸梭菌NK和丁酸梭菌SY低。

2.2.2 还原糖的变化 碳源作为微生物生长不可或缺的能量来源之一，丁酸梭菌和酪丁酸梭菌所能够利用的碳源以葡萄糖为最佳，所以在合成发酵培养基中，以葡萄糖为碳源。如图6所示：发酵结束后，4株菌种均有葡萄糖剩余，其中丁酸梭菌NK、丁酸梭菌SY和丁酸梭菌RX在32 h时葡萄糖残留值相当，分别为20.02，19.26，20.56 g/L，此后剩余葡萄糖变化不大，说明发酵趋于停止。在相同的发酵条件下，酪丁酸梭菌比每一株丁酸梭菌产丁酸量都要多，所以酪丁酸梭菌ATCC25755较3株丁酸梭菌而言，剩余葡萄糖较少，为14.35 g/L。4株菌种均有葡萄糖残留的原因是随着发酵进行酸的产生，导致pH 下降，pH下降到一定程度，进入衰亡期，细胞代谢能力减弱。这与Fu等[23]的研究结果趋势是一致的。

图3 菌株NK、SY、RX 基于16S rDNA基因发育树Figure 3 16S rDNA gene-based phylogenetic tree of strain NK SY RX

图4 丁酸梭菌和酪丁酸梭菌的生长曲线Figure 4 Growth curve of Clostridium butyricum andClostridium tyrobutyricum

图5 丁酸梭菌和酪丁酸梭菌在合成培养基发酵的生物量变化

Figure 5 Biomass changes in the synthetic medium during fermentation ofClostridiumbutyricumandClostridiumtyrobutyricum

2.2.3 pH的变化 pH对微生物生长具有显著影响，一般细菌的生长最适pH值为7左右，所以发酵培养基的初始pH设为7。接入种子培养液之后，丁酸梭菌NK、丁酸梭菌SY、丁酸梭菌RX 和酪丁酸梭菌ATCC25755的初始pH分别为6.30，6.17，6.25，6.23。随着发酵时间的延长，由于上述菌株均是以产丁酸为主的菌株，发酵液的pH呈逐渐降低趋势。3株不同的丁酸梭菌虽然来源不同，但是对酸的耐受度却相差不大，32 h细胞生物量基本上达到最大值，还原糖也不再消耗(图7)，此时丁酸梭菌NK、丁酸梭菌SY和丁酸梭菌RX的pH分别为4.22，4.29，4.24。与3株丁酸梭菌相比较，酪丁酸梭菌对酸的耐受力较强，发酵结束后，发酵液的pH值为3.85。

图6 丁酸梭菌和酪丁酸梭菌在合成培养基发酵的还原糖变化

Figure 6 Changes of reducible carbohydrate in the synthetic medium during fermentation ofClostridiumbutyricumandClostridiumtyrobutyricum

图7 丁酸梭菌和酪丁酸梭菌在合成培养基发酵的pH变化

Figure 7 Changes of pH in the synthetic medium during fermentation ofClostridiumbutyricumandClostridiumtyrobutyricum

2.2.4 产酸量的变化 不同菌株对原料的利用率及产酸能力不同。菌株利用葡萄糖发酵的产酸量变化如图8所示。由图8可知，菌株丁酸梭菌NK、丁酸梭菌SY及丁酸梭菌RX的丁酸产量变化趋势相同，前8 h丁酸产量缓慢增长，8～24 h持续快速增长。据孔青[24]研究，丁酸梭菌产物形成与菌体生长的关系为非生长偶联性，菌株在细胞生长进入稳定期才开始产生大量丁酸。到后期，丁酸梭菌菌株由于pH的胁迫和细胞衰亡等原因，产丁酸速率减缓。比较丁酸最后的积累量发现，丁酸梭菌NK和丁酸梭菌RX产丁酸能力差异不大，分别为2.07，1.97 g/L，得率(丁酸产量/葡萄糖消耗量)分别为0.23，0.21 g/g，丁酸梭菌SY稍低于二者，产丁酸量为1.66 g/L，得率为0.17 g/g。酪丁酸梭菌ATCC25755产丁酸能力很强，8～48 h时产丁酸量保持快速增长，最终达到6.47 g/L，得率为0.41 g/g。Luo等[18]研究发现在初始葡萄糖浓度为75 g/L 时，酪丁酸梭菌ATCC25755发酵产丁酸得率为0.36 g/g。

除丁酸外，丁酸梭菌和酪丁酸梭菌发酵产物还有乳酸[25]，由乳酸脱氢酶催化丙酮酸而得到。如图9所示，丁酸梭菌NK、丁酸梭菌SY和丁酸梭菌RX发酵葡萄糖的乳酸产量变化趋势相同，前8 h快速增长，32 h后基本达到稳定，产量分别为0.44，0.37，0.41 g/L。酪丁酸梭菌ATCC25755利用葡萄糖发酵产乳酸量较少，仅为0.046 g/L，这是因为在其细胞代谢流向中，碳作为分子骨架偏向于合成丁酸。

图8 丁酸梭菌和酪丁酸梭菌在合成培养基发酵的产丁酸量变化

Figure 8 Changes of butyric acid production inClostridiumbutyricumandClostridiumtyrobutyricumduring fermentation on synthetic medium

图9 丁酸梭菌和酪丁酸梭菌在合成培养基发酵的产乳酸量变化

Figure 9 Changes of lactic acid production in the synthetic medium during fermentation ofClostridiumbutyricumandClostridiumtyrobutyricum

3 结论

本研究从人粪便、窖泥和动物肠道内容物分离筛选出3株梭状芽孢杆菌，并通过16S rDNA核苷酸序列鉴定均为丁酸梭菌，分别命名为ClostridiumbutyricumNK、ClostridiumbutyricumSY、ClostridiumbutyricumRX。3株丁酸梭菌具有不同的发酵特性，在合成培养基中，丁酸梭菌NK和丁酸梭菌RX的产酸能力优于丁酸梭菌SY。另外，丁酸梭菌与酪丁酸梭菌相比较，由于种属的差别，发酵特性差异显著。酪丁酸梭菌产丁酸能力优于丁酸梭菌。然而，丁酸梭菌的生长能力和产乳酸能力高于酪丁酸梭菌。通过以上不同种和同种不同株的比较，为研究其代谢途径差异提供基础，以望进一步从代谢关键点出发，进行基因改造，从而构建出优良的适合工业生产的基因工程菌。