DPYD、ABCB1、GSTP1、ERCC1基因多态性与晚期结肠癌临床特征、不良反应、预后的关系

苟苗苗 张勇 千年松 司海燕 高云鹤 陈凛 戴广海

大肠癌在我国发病率逐年上升，是我国发病率和死亡率第3的癌种［1］。随着化疗药物及靶向药物的出现，晚期大肠癌患者的生存时间延长［2-3］。以西妥昔单抗和贝伐珠单抗联合奥沙利铂、氟尿嘧啶类及伊立替康药物为主的化疗方案成为晚期大肠癌的标准一线治疗方案［4-5］。虽然晚期肠癌患者的总生存时间（overall survival，OS）最长达到40个月，但部分患者因无法耐受化疗不良反应或发生原发性耐药或者继发性耐药而停止治疗。在临床观察中发现即使大肠癌患者单纯接受相同化疗方案相同药物剂量治疗时，在治疗疗效和耐受性方面也存在较大的个体差异。有相关研究发现关于药物DNA损伤修复、药物代谢和解毒等基因存在单核苷酸多态（single nucleotide polymorphisms，SNPs）［6-7］，这些多态性影响不同个体对药物的敏感性和毒性。关于晚期大肠癌的基因多态性相关文献分子机制尚不明确，且说法不一，有待进一步研究。本研究是通过Life平台检测基因技术检测晚期肠癌的基因多态性，分析其与临床特征、奥沙利铂和氟尿嘧啶为主方案不良反应和预后的关系，从而个体化管理患者的治疗方案和剂量，预防严重不良反应发生和预测生存。

资料与方法

一、研究设计

收集2016年3月至2018年5月在中国人民解放军总医院肿瘤治疗中心初治的108 例晚期结肠癌患者化疗前晨起外周血。其中男性患者70例，女性患者38例，年龄34～75岁，中位年龄53岁，所有患者均经病理学证实为结肠癌患者。所有患者均存在远处转移，初治时体力状态评分（performance score，PS）≤2分，可耐受化疗。

二、化疗方案与评价标准

所有患者均接受以奥沙利铂和氟尿嘧啶为主的一线化疗：L-OHP 85 mg/m2，静滴 2 h，d1；CF 200 mg/m2，静滴 2 h，d1～d5；5-Fu 400 mg/m2，静滴 4 h，5-Fu 600 mg/m2，泵入 46 h；每 2 周重复，或者 L-OHP 130 mg/m2，静滴 2 h，d1；Xeloda 1.5g po bid，d1～d14。每 3 周重复。

临床评价标准：结直肠癌分期标准采用第七版AJCC的TNM分期标准。108例晚期大肠癌患者应用以奥沙利铂和氟尿嘧啶的化疗方案，每2或3周期进行影像学评估，使用实体肿瘤的疗效评价标准RECIST1.1版，分为完全缓解（complete response，CR）、部分缓解（partial response，PR）、疾病稳定（stable disease，SD）、疾病进展（progression disease，PD）。病情进展后更换方案，所有患者均观察无进展生存期（progression-free survival，PFS），即从首次化疗开始至证实病情进展时间。不良反应包括骨髓抑制、腹泻、神经毒性、乏力、口腔黏膜溃疡、消化道反应、皮肤色素沉着等。化疗后毒性反应根据常见不良事件评价标准（CTCAE）评估。不良反应的收集基于整体化疗周期中最高级别记录。

三、检测方法

Life平台检测是泛生子通过自主专利One Step Seq技术进行建库，后续通过Ion proton测序系统完成上机测序。1. One Step Seq 建库：（1）将本公司设计的 One Step Seq扩增引物、barcode引物、待检测的DNA模板、酶按SOP要求混合成所需的扩增体系；（2）一步法PCR反应进行扩增；（3）PCR结束后使用磁珠纯化产物，去掉引物二聚体， 通过质控后，得到满足上机要求的文库。2.上机测序：使用 Ion Torrent™ Ion Proton 测序平台进行测序。（1）文库经过油包水PCR过程完成模板富集纯化，形成测序微珠；（2）将测序微珠加载到测序芯片上；（3）在proton测序仪上完成对测序芯片的检测使用Ion Proton测序系统，测序过程只需2.5 h即可完成，并且能够自动给出分析结果。

四、统计学分析

使用SPSS 20.0软件行统计学分析，SNP基因多态性分布情况经Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验。计数资料以率（%）表示，组间比较采用χ2检验，采用Fisher确切概率法，以P＜0.05为差异有统计学意义。对 108例患者进行长期随访，用Kaplan-meier法计算生存曲线，用Log-rank检验比较不同基因型的PFS（即生存时间）差异。

结 果

一、基因分型及临床特征

108例晚期肠癌患者纳入检测，共检测了DPYD、ABCB1、GSTP1、ERCC1等4个基因。其 中 DPYD 4个位 点（rs3918290、rs55886062、rs67376798、rs2297595）均为野生型，该样本不符合遗传平衡检验。ERCC1rs11615基因频率分别为：AA野生型5.6%（6/108），AG杂合型46.3%（50/108），GG纯和突变型48.1%（52/108），经Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验（χ2=0.928，P=0.335），该样本达到了遗传平衡。GSTP1基因频率分别为：野生型61.1%（66/108），杂合型33.3%（36/108），纯和突变型5.6%（6/108），经Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验（χ2=0.069，P=0.793），该样本达到了遗传平衡。ABCB1基因频率分别为：野生型7.4%（8/108），杂合型53.7%（58/108），纯和突变型38.9%（42/108），经Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验（χ2=1.996，P=0.158），该样本达到了遗传平衡。基因分型见表1。

表1 ERCC1、GSTP1、ABCB1基因多态性频率分布（例，%）

结合患者临床特征，观察KRAS状态和原发灶的位置与基因分布频率的关系。结果发现肿瘤位于左右半结肠与ERCC1基因分布有关（χ2=4.802，P=0.028），与GSTP1、ABCB1基因分布频率无关（χ2=3.691；P=0.055；χ2=1.812，P=0.178）。在92例KRAS状态明确的患者中，KRAS突变型患者ABCB1 AG杂合突变率42.9%，KRAS野生型AG杂合突变率为72.7%，两者差异具有统 计 学 意 义（χ2=3.939，P=0.047），ERCC1，GSTP1基因分布频率与KRAS基因状态无关（χ2=3.495，P=0.062；χ2=0.703，P=0.402）。见表2。

表2 ERCC1、GSTP1、ABCB1基因多态性与KRAS基因状态、左右半部位的关系（例）

二、不同基因频率与不良反应之间的关系

ERCC1不同基因频率与不良反应无关（χ2=0，P=0.984）， 而 GSTP1 AG 型和 GG 型较 AA 型易产生 2～3级全身不良反应（77.8% vs. 45.5%，χ2=5.193；P=0.023）。ABCB1 GG 型和 AA 型 患者发生3～4级不良反应率为32.9%，对比AG型患者发生3～4级不良反应率为62.1%，差异具有统计学意义（χ2=4.862，P=0.027）。见表3。

表3 ERCC1、GSTP1、ABCB1基因多态性与不良反应之间的关系

三、不同基因型与预后关系

随访108患者化疗后中位无进展生存时间（PFS），中位PFS与ABCB1和GSTP1基因多态性无关（P=0.501，P=0.191），与ERCC1不同基因型有关，ERRC1杂合型突变（AG型）患者较纯和型（GG型＋AA型）具有较短PFS（5.6 m vs. 8.0 m，P=0.029）（图1）。

图1 ERCC1基因突变类型与中位无疾病进展生存时间（PFS）关系

讨 论

ERCC1是哺乳动物细胞DNA修复系统途径中的一种重要的酶，与XPF形成复合物切开受损DNA链的5′端，XPG切开受损DNA链的3端，从而切除受损的片段［8］。ABCB转运蛋白家族（ATP binding cassette transporter super family）是一大类跨膜转运蛋白，主要功能是利用ATP水解产生的能量将与其结合的底物包括化学物质和药物等主动泵出细胞外。ABCB1［9］又称为多药耐药基因，编码P-糖蛋白（P-gp），多种化疗药物与P-gp结合泵出细胞外。GSTP1为谷胱甘肽转移酶（glutahione S-trans-ferase，GST）P1是参与外来化学物质解毒和致癌物质代谢灭活的多功能药物代谢酶，它可以通过防止DNA损伤和DNA复合物形成参与奥沙利铂等铂类抗癌药物的代谢，但同时其基因多态性也可以造成肿瘤细胞对化学治疗药物的耐药［9］。晚期肠癌化疗药物主要是奥沙利铂联合氟尿嘧啶类药物或伊立替康联合氟尿嘧啶类药物。上述基因均参与肠癌化疗药物代谢、功能等。因DPYD不符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验，未纳入后续研究。

肠癌靶向治疗联合化疗的时代，研究着争论靶向药物如何与化疗更好的配伍和选择。“左右半”之争是2015以来最热议的话题之一。首先明确了的一个观点就是肿瘤部位是Ⅲ/Ⅳ期结直肠癌独立的预后因素［5］，右半结肠癌预后显著差于左半结肠和直肠，与治疗手段无关［2］。其次，原发瘤部位是EGFR靶向治疗的负性疗效预测指标［5］。大多数研究者认为左右半结肠在胚胎起源、解剖学供应、肿瘤的临床表现，导致了更重要的分子生物学特征的差异［10-12］。基因多态性的频率分布是否与肿瘤原发部位左右半肠癌相关，是否影响了肿瘤的治疗及预后，关于这部分目前没有报道。本研究探索了与肠癌化疗药物相关的ERCC1，ABCB1，GSTP1基因多态性与肿瘤部位的关系。研究发现肿瘤位于左右半结肠与ERCC1基因分布有关，与GSTP1、ABCB1基因分布频率无关。右半肠癌ERCC1的AG型杂合突变率为40.0%，而该基因在左半肠癌AG型杂合突变率为60%，差异具有统计学意义。ERCC1［8］与奥沙利铂、氟尿嘧啶类药物化疗后导致的DNA损伤修复有关，对于ERCC1突变类型与化疗疗效的关系说法不一。本研究结果提示左右半肠癌ERCC1基因突变频率存在差异，这也从基因层面进一步验证左右半肠癌患者在生物学特征方案存在更多的差异，导致左右半肠癌预后结果不同。KRAS状态也是影响肠癌预后的重要因素［13］，同时KRAS突变患者无法从西妥昔单抗中获益。92例KRAS状态明确的晚期肠癌患者中，KRAS突变患者ABCB1 AG杂合突变率42.9%，KRAS野生型AG杂合突变率为72.7%，两者差异具有统计学意义（χ2=3.939，P=0.047），这也提示KRAS突变患者部分药物基因多态性存在差异，进而导致药物的代谢浓度或耐药性方面发生改变，从而影响生存时间。还需要进一步扩大样本量再次验证统计学上无差异的基因的多态性分布。

本研究结果显示，晚期肠癌患者应用奥沙利铂和氟尿嘧啶类药物的化疗方案时，GSTP1 AG型和GG型较AA型易产生2～3级全身不良反应的风险高，发生这一现象的原因可能是GSTP1 r1695由A到G的改变导致了编码氨基酸的改变，蛋白功能性下降，使得药物代谢排毒的能力下降，进而导致毒副作用增强。GSTP1在晚期肠癌的化疗毒副反应方面的研究相对较少，但这个现象在乳腺癌［14］、肺癌［15］研究中得到了验证。ABCB1 AG型患者发生3～4级不良反应率为62.1%，明显高于其他组。目前关于ABCB1的研究大多数在乳腺癌中。有报道显示使用紫杉类药物的患者检测ABCB1（3435T＞C）野生纯合型（TT型）患者发生血液学毒性的风险高于其他基因型［16］。另有研究表明［17］ABCB1 2677G＞T/A基因多态性可能与乳腺癌患者AC联合化疗所致严重中性粒细胞减少症风险增加有关。这些在乳腺癌中的结论似乎与本研究中的结论不一致，可能原因是这些基因产生的功能蛋白在各个癌种中不同化疗药物中作用机制不一致。一项关于肠癌的研究是Eva Gonzalez-Haba等人发现ABCB1基因的单核苷酸多态性与卡培他滨和5-Fu的不良反应相关，基因型为rs1045642（C3435T）的患者使用卡培他滨治疗时发生手足综合征也明显降低（P=0.033），但使用5-Fu治疗发生腹泻则明显增加（P=0.035）［18］。通过对晚期肠癌患者基因多态性的检测，可以预测患者应用化疗后发生不良反应的风险，为临床安全用药提供了一定依据。有望根据本研究所得结论，提出针对性的预防方案，从而保障患者用药安全。

目前研究最多的还是基因多态性与肿瘤治疗预后的关系。吕红英等［19］研究GSTP1基因多态性与晚期肺癌铂类化疗疗效和生存，发现GSTP1 A/G＋G/G基因型的中位生存时间为8.0个月，A/A基因型为6.0个月，差异有统计学意义（χ2=14.688，P＜0.01）；沈冬亚等［20］研究GSTP1，ERCC1基因多态性与结直肠癌FOLFOX化疗方案疗效相关性研究，发现患者性别、年龄、结直肠癌分期（TNM）及肿块部位等和FOLFOX化疗疗效均无明显相关性（P＞0.05），GSTP1单核苷酸多态性与结直肠癌对FOLFOX方案化疗疗效相关。梁军等［21］研究发现99例晚期大肠癌患者中位TTP为7个月，ERCC1C/C基因型患者中位TTP为10个月，C/T＋T/T型患者中位TTP为5个月，二者差异有显著统计学意义（P＜0.01）。本研究中ERRC1杂合型突变（AG型）患者较纯和型（GG型＋AA型）具有较短 PFS（5.6 m vs. 8.0 m，P=0.029）。这个结果和梁军等人的研究结果相似。Park等［22］解释该现象可能是因为A等位基因携带者的ERCC1mRNA水平更高，DNA修复能力更强，这与本实验观察到的GG基因型患者有较好的化疗反应相一致。本研究中ABCB1和GSPT1与患者中位PFS无关，考虑ERCC1与奥沙利铂修复相关，ABCB1和GSTP1不仅与奥沙利铂相关，还与氟尿嘧啶类药物的代谢有关，所以ERCC1的基因多态性更能单纯反映化疗的疗效。

综上所述，结合ERCC1、GSTP1、ABCC1的基因多态性和临床特征及化疗方案，从遗传信息标记物层面更多的评估不良反应与预后，为结直肠癌个体化、精确化治疗提供可行的理论依据。