亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与大剂量甲氨蝶呤不良反应的相关性研究

何 霞，姚平立，吴 宇，侯正尧，李星星，张 远，串俊兰，钟 磊，肖洪涛，，童荣生，

(1.四川省医学科学院·四川省人民医院药学部，四川 成都 610072；2.电子科技大学医学院，四川 成都 611731)

急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)是临床常见的恶性血液肿瘤疾病，其发病率高，进展迅速，且在儿童中更为显著[1]。甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)是治疗ALL的一线药物，MTX是一种竞争性叶酸还原酶抑制剂，通过与二氢叶酸还原酶的结合阻碍四氢叶酸合成，进而抑制肿瘤细胞的生长繁殖。与常规剂量MTX相比，大剂量甲氨蝶呤(HD-MTX)可更好地克服耐药性，故广泛用于髓外白血病的防治。不同患者对MTX的敏感性及耐受程度不同，可能出现不同的化疗副反应，药物基因多态性(SNP)被认为是影响HD-MTX不良反应的重要因素之一[2]。本研究拟探讨亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)的SNP与ALL患儿使用HD-MTX后不良反应发生的相关性。

1 资料与方法

1.1一般资料纳入2015年10月至2018年9月在四川省人民医院儿科血液组确诊为ALL的住院汉族患儿70例。具体诊断标准、危险度分型及治疗方案均参照儿童急性淋巴细胞白血病诊疗建议(第四次修订)[3]。所有纳入研究的患儿处于HD-MTX巩固化疗阶段，年龄0～16岁；排除早期强化治疗后未完全缓解以及HD-MTX 化疗前血常规和肝肾功、电解质、心肌酶学指标不正常者。其中男45例，女25例，年龄(8.27±4.65)岁；免疫分型B型患儿44例，T型12例，其他12例；危险度分级[3]：标危患儿3例，中危18例，高危49例。该研究在中国临床实验中心注册，通过我院医学伦理委员会批准，所有对象的诊疗已征得监护人同意并签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1给药方法 参照儿童ALL 诊疗建议[3]，MTX 以低危组为2.0 g / m2，中危及高危组均为 5.0 g/m2的剂量给药，总剂量的 1 /10作为突击量于前 30 分钟内快速静脉滴入，余量于后 23.5 h内匀速滴入。突击量MTX 滴入后 0.5～2 h，进行三联鞘内注射 (MTX12.5 mg、阿糖胞苷35 mg，地塞米松5 mg)。

1.2.2MTX血浆浓度测定 经HD-MTX治疗患儿于静脉滴注MTX后24 h、48 h、72 h采对侧上肢静脉血2 ml于抗凝管中，使用均相酶放大免疫分析技术(EMTI)(西门子Viva-E全自动分析仪)测定MTX血浆浓度。

1.2.3基因分型检测 采外周静脉血2 ml，EDTA抗凝，用血液基因组柱式小量提取试剂盒(康为世纪公司，批号：20228)提取基因组DNA，微量核酸蛋白检测仪(NanoDrop 2000)检测DNA 浓度和纯度，浓度：10～30 ng/μl；A260/A280：1.6～2.0。MTHFR基因分型采用MTHFR基因检测试剂盒(武汉友芝友医疗科技股份有限公司，批号：18030502)。实时荧光定量PCR(ABI7500)进行扩增，扩增条件：37 ℃ 10 min，95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s共40个循环。

1.3不良反应评价监测根据美国国立癌症研究所常见不良反应评价标准(NCI-CTCAE V4.0) 对患儿进行HD-MTX巩固化疗期首次HD-MTX给药后7天内产生的不良反应进行统一评价，若分级≥2则被认为是发生临床相关的化疗不良反应。评价观察主要不良反应(ADR)包括：骨髓抑制、肝功能异常、胃肠道反应、黏膜损害、皮疹、继发感染、神经系统毒性以及肾功能损害。

1.4统计学方法采用SPSS 23.0统计分析。计量资料采用均数±标准差表示，非正态分布数据表示为“中位数(Q25，Q75)”。秩和检验比较基因多态性与MTX48 h剂量校正浓度差异，卡方检验分析MTHFR各基因型分别与72 h血药浓度是否>0.1 μmol/L 和不良反应是否发生的相关性，并根据野生型及突变型进行分组比较；Logistic回归分析年龄、性别、BMI、免疫分型、危险度分型、MTX给药剂量、血药浓度、基因型等因素与不良反应发生的相关性。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1基本人口学信息该研究共纳入70例患儿，基因分型结果MTHFR C677 T中野生基因型CC型患儿25例，突变基因型CT型37例，纯合突变基因型TT型8例；MTHFRA1298C中野生基因型AA型患儿38例，突变基因型AC型28例，纯合突变基因型CC型4例。该研究所涉及所有基因分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P> 0.05)。

2.2基因型与HD-MTX化疗后MTX浓度的关系

用药24 h血药浓度数据缺失较多，予以剔除，不做分析。因血药浓度监测方法限制(最低检测限0.1 μmol/L)，用药48 h血药浓度以具体数值表示，用药72 h血药浓度以≤0.1 μmol/L或>0.1 μmol/L具体患儿例数表示。MTHFR C677 T、A1298C不同基因型的用药48 h剂量校正浓度之间差异无统计学意义(P> 0.05)，MTHFR C677 T、A1298C不同基因型与用药72 h血药浓度是否>0.1 μmol/L差异无统计学意义(P> 0.05)，见表1。

表1 不同基因型血药浓度的差异

2.3基因型对不良反应发生的影响统计显示骨髓抑制发生率最高，共38例(54.2%)，肝功能异常23例(32.9%)，胃肠道反应15例(21.4%)，黏膜损害27例(38.6%)，皮疹4例(5.7%)，继发感染29例(41.4%)，神经系统损害4例(5.7%)，肾功能损害发生最少，仅2例(2.9%)。其中，仅观察到MTHFR C677 T CC型(11例)组的胃肠道反应发生高于CT型(3例)、TT型(1例)组差异有统计学意义(P< 0.05)。

2.4多因素对不良反应的发生的影响Logistic回归分析提示：72 h血药浓度>0.1 μmol/L患儿更易发生胃肠道不良反应；C677 T 基因多态性也是胃肠道反应的发生的影响因素之一；BMI值、免疫分型可能是患儿发生黏膜损害的影响因素，且提示T系患儿更易发生黏膜损害；体重的数值可能影响患儿皮疹发生。见表2。

表2 ADR发生的影响因素分析

3 讨论

MTHFR是叶酸循环中有重要作用的酶，催化5，10-亚甲基-THF还原为5-甲基-THF。鄢欢等[4]发现677C/T型基因突变使缬氨酸替代丙氨酸，导致MTHFR酶的活性下降，造成细胞内同型半胱氨酸浓度增高，改变了叶酸分布；MTHFR 1298中C碱基替换了A碱基后，谷氨酸被丙氨酸所替代，导致MTHFR活性降低，两者的突变均会对叶酸体内代谢造成影响。本研究发现C677 T位点 CC型发生胃肠道反应的概率显著高于突变型(CT+TT型)，可推测677CC型患者可能出现更严重的药物毒性反应，其 C>T位点的突变可能对胃肠道有一定的保护作用。Zhu报道[5]C677 T与HD-MTX所致胃肠道反应发生相关，提示C677 T位点多态性可能是HD-MTX化疗后胃肠道反应发生与否的重要因素之一。目前关于MTHFR A1298C 基因型与HD-MTX 化疗相关不良反应亦有较多报道，但结论不一致[6，7]。本研究未发现A1298C基因型与血药浓度和不良反应的相关性，可能需要进行多中心、大样本的研究来验证。

FDA建议临床可通过监测MTX血药浓度来指导个体化用药，达到提高疗效并减少不良反应发生的目的，MTX 24 h血药浓度可用于预测疗效，而48、72 h血药浓度则用于反映MTX在体内的消除情况、特别是72 h是否≤0.1 μmol/L用于指导CF解救疗程以及预防不良反应的发生[8]。本研究结果显示72 h血药浓度可能影响患儿胃肠道反应的发生，魏盈盈等[9]的研究也有相同结论，提示血药浓度监测对于HD-MTX的安全用药具有积极的指导作用。该研究分析得到患儿在给药前的BMI值、免疫分型类型及体重数值可能分别为HD-MTX所致黏膜损害、皮疹的发生的危险因素。提示在ALL患儿的临床治疗中，密切监控患儿的体重、BMI数值等指数，明确做好患儿免疫分型，对临床治疗ALL患儿，减少HD-MTX化疗不良反应有积极作用。

近年来，许多学者认为MTHFR基因多态性可以作为ALL预后及化疗相关不良反应的预测指标，部分医院已经将药物基因检测项目纳入医院常规检测项目，用于指导疾病的治疗与预后[10]。本研究病例数量有限，但其结果可为儿童安全应用HD-MTX提供参考建议，为后续相关研究提供信息。