补充虾青素对人体急性大强度运动后代谢组学的影响

2019-04-22郭新明吴丽君

体育研究与教育 2019年2期

郭新明，吴丽君，孙卓，赵静

研究证实：自由基是许多生理与病理过程的调节因子[1,2]。它以活性氧(reactive oxygen species，ROS)和活性氮(RNS)为信使调节机体的各种生物反应过程，包括基因表达、血管生成、先天性免疫、细胞程序性衰老和死亡等[3,4]。

在大强度运动过程中，肌肉组织对氧的需求量急剧增加，线粒体电子漏产生增加与激活的黄嘌呤途径都加剧了自由基的产生[5]。体内过量的自由基会导致冠心病(atherosclerosis)、糖尿病(diabetes)、白内障(cataract)、衰老(aging)以及癌症(cancer)等疾病[6,7]。已有学者以动物和人为研究对象，对番茄红素、原花青素、中药提取物等天然抗氧化物消除由运动产生的自由基进行了研究。结果显示它们皆具有消除由运动产生的自由基的作用[8]。

虾青素(ASTA)作为新一代抗氧化物，是一种链断裂型抗氧化剂，具有极强的抗氧化及健康促进作用，如预防视力疲劳、改善皮肤代谢、保护免疫系统等[9]。在运动科学领域，虾青素还具有缓解运动疲劳、增加肌肉力量和肌肉耐力、减轻由剧烈运动引起的肌肉内炎症反应等作用[10,11]。本研究采用核磁共振(1H-NMR)代谢组学技术，研究补充虾青素对人体在安静状态下以及急性大强度运动后血浆小分子代谢物的影响，试图从代谢角度阐明虾青素抗氧化并对运动机体机能产生影响的作用途径与机理。

1 受试对象与方法

1.1 受试对象与分组

选取体育学院2016级体育教育专业8名男生为受试对象，其基本状况如下表所示。8名受试者均经过常规体检、病史询问，排除重大疾病史、近期上呼吸道感染和心血管病史，且受试者近期均未服用番茄红素、原花青素、维生素E、维生素C、红景天和黄芩等自由基清除剂及中药补剂。

表1 受试者基本状况一览表(n=8)

1.2 实验仪器与试剂

选用瑞典产Monark874E定量负荷功率自行车完成急性大强度运动；选用TGL-16 高速台式冷冻离心机，XW-80A涡旋混合器、Brucker600-MH2 AVACNCE Ⅲ NMR谱仪(600.13 NIH2 proton frengnency，布鲁克公司，德国)、D2O(重水，默克试剂公司，美国)、PBS(phosphate buffer saline)缓冲液等完成代谢组学测定。实验用虾青素选用湖北雅仕达生物技术有限公司艾诗特虾青素软胶囊500mg/粒(每粒含虾青素≥4mg，鄂食健字：2012第0014号)。

1.3 运动方案

受试者全力蹬骑功率30s×3/间歇3min，负荷为0.075kg/kg体重[12]。蹬骑前根据受试者身高等调节脚带扣等，适应性蹬骑1min后正式开始。测试人员发出口令，受试者用全力蹬骑30s。完成后休息3min。循环3次[8]。

1.4 实验设计

所有受试者实验前已被告知实验流程及注意事项。受试者承诺遵守实验规则，试验期间正常作息，无酗酒、熬夜等不良生活习惯。试验期间如有生病等意外情况立即退出实验。

(1)实验第1天，所有受试者于清晨空腹第一次肘静脉采血，标为E1；当晚21:00第一次服用虾青素3粒，即12mg虾青素。以后每晚同一时间服用，连续服用35d。

(2)实验第29天，所有受试者于清晨空腹第二次采血，标为E2；采完血进行蹬骑功率自行车运动。在运动后即刻、1h分别采血，标为E3、E4。

(3)实验第30天，所有受试者清晨空腹进行第五次采血，标为E5。

(4)实验第36天，所有受试者清晨空腹进行第六次(最后一次)采血，标为E6。

1.5 样本收集、保存与处理

每次采集肘静脉血5mL，置于含肝素钠抗凝管内，经6 000r/min离心30min后，取上清液(血浆)1mL置于干净的EP管内，-80℃冰箱保存待测。

1.6 NMR数据采集与处理

样品处理：将血浆样品放置于冰水混合物中解冻后，取450uL到容量为2mL的EP管中，加入900uL甲醇。涡旋2min使之充分反应，再放入TGL-16高速台式冷冻离心机中4℃、13 000r/min离心30min。离心后取900uL上清液到容量5mL的EP管中，经氮吹仪空气源吹干后加入600uL PBS缓冲液在超声清洗器作用下复溶。待充分溶解后取550uL加入内径为5mm的核磁管，标记好，4℃保存，待测。

NMR序列设置：将放有样品的核磁管进行1H-NMR检测，采用CPMG(Carr-Purcell-Meiboom-Gill)脉冲序列。CPMG脉冲序列的优点是可以压制水峰及大分子物质信号，从而增加样品中小分子物质敏感性。自旋弛豫延迟320ms，自由感应衰减64K数据点，谱宽8KHz，64次扫描。

NMR数据处理：得到样本的核磁信号后，使用MestReNova软件(Mesterlab Research, Santiago de compostella, Spain)对图谱进行傅立叶转换，再调整基线、校正相位。以TSP(total suspended particulate)的化学位移为基准校正1H-NMR谱图的位移。对0.5ppm～9ppm的图谱进行等宽度分割，切除4.5到6.2的水峰信号，再分段积分后将积分值保存于Excel中，将数据归一化处理后进行多元统计分析。用SIMCA-P11.0(Umetric，Sweden)对积分值进行中心化与规格化后，对其进行PLS-DA、OPLS-DA分析，最终结合p值与VIP值找出差异代谢物。

2 结果

2.1 受试者血浆小分子代谢物的1H-NMR代谢图谱指认

本实验所采集的1H-NMR图谱如图1，结合文献对其进行小分子物质指认[13,14]，结果如表2。指认出的物质主要有：有机酸(包括柠檬酸、乳酸、醋酸、肌酸、乙酰乙酸等)；氨基酸(包括谷氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、缬氨酸、酪氨酸等)；葡萄糖、肉毒碱、脂质等。

2.2 受试者不同时期相比较的血清生物代谢标志物

将MestRenova软件处理后的数据导入SIMCA-P软件中，采用PLS-DA方法进行分析，得到得分图(图2A)，用OPLS-DA分析得到载荷图(图2B)。得分图中每一个点代表一个样本。所含物质含量越相同的样本位置上越接近，因此，图中同一组的样本距离较近，甚至发生重叠，而不同组的样本距离较远，分布在不同区域。

载荷图中每个点代表一种小分子物质。VIP值越大的点(即离原点越远的点)对受试者不同时期的血浆样本分离贡献越大。PLS-DA模型质量验证用R2和Q2两个参数分别表示模型的解释能力和预测能力。经过200次验证得到模型交叉验证分析图(图2C)。只有模型成立才能证明PLS-DA和OPLS-DA分析结果有意义。

注：数字标注所表示物质如表2。E1表示服用虾青素之前；E2表示服用虾青素28d后，即运动前；E3表示运动后即刻；E4表示运动后1h；E5表示运动后1d；E6表示运动后1w。

图1 受试者不同时期血清1H-NMR图谱(ppm)

注：s：singlet，单峰；d：doublet，双重峰；t：triplet，三重峰； q：quartet，四重峰；m：multiplet，多重峰；dd： doublet of doublet，双重双峰。

2.2.1服用虾青素前后受试者的血清代谢标志物由图2A得分图可知：虾青素干预前后的血浆样本可以完全分开，说明在虾青素干预下，人体血液中的小分子物质含量发生了显著变化。在图2B中，离原点较远的点才可能成为代谢标志物。图2C则说明PLS-DA模型成立。采用SPSS对检测出的代谢物浓度进行t检验，选出p<0.05的代谢物，再结合OPLS-DA分析得出的VIP值进行筛选，同时满足p<0.05且VIP>1的代谢物确定为生物代谢标志物。经过分析，最终我们找出了4个差异生物代谢标志物，如表3。服用虾青素后，受试者血浆中的乳酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘油水平较服用前均发生了显著变化。

注：A为PLS-DA得分图；B为OPLS-DA载荷图；C为PLS-DA模型验证分析图。

图2服用虾青素前后受试者血清代谢标志物分析图

δ(ppm)代谢标志物服用前服用后变化趋势1.33/4.12乳酸42.66±6.7535.27±2.07∗∗↓2.07/2.35谷氨酸3.90±0.722.95±0.29∗∗↓2.16/2.45谷氨酰胺2.79±0.242.45±0.25∗↓3.67/3.78甘油3.01±0.173.34±0.23∗↑

注：*表示与服用前相比，P<0.05；**表示与服用前相比，P<0.01。

2.2.2运动后恢复期受试者的血浆代谢标志物本阶段要寻找的差异代谢标志物为在虾青素的干预下，运动前与运动后恢复期受试者血浆中的小分子代谢物的变化。体现为运动前与运动后即刻、运动后即刻与运动后1h、运动后1h与运动后1d、运动后1d与运动后1w之间受试者血浆1H-NMR图谱代谢轮廓的变化，即E2与E3、E3与E4、E4与E5、E5与E6之间的对比。经分析：E5与E6之间无法拟合，模型不成立，所以本次结果中不包含E5与E6之间对比的结果。经t检验得出的P值以及OPLS-DA分析得出VIP值，最终确定了以下几种代谢标志物，见表4。

表4 受试者运动前后不同时期血液代谢标志物寻找结果

注：*表示与前一阶段相比，P<0.05；**表示与前一阶段相比，P<0.01。

3 讨论

3.1 补充虾青素对受试者血清小分子物质代谢的影响

有研究表明：补充虾青素可使血液中的超氧化物歧化酶、过氧化氢酶等大分子物质的含量发生变化[15]。本研究采用1H-NMR技术可识别出分子量小于1 000的小分子物质，如各种氨基酸、肌酸、肉毒碱等。

实验结果可见，经中等剂量口服虾青素28d干预后，受试者血浆中的乳酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘油含量发生了显著变化。

正常情况下，人体组织细胞从内环境中吸收葡萄糖在细胞质进行一系列反应，将一分子葡萄糖分解为两分子丙酮酸。氧供不足时，丙酮酸会直接在细胞质中被乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase，LDH)转化为乳酸，血液将乳酸运送至肝脏、肾脏，肝肾细胞通过糖异生作用再将乳酸转化为丙酮酸，再转化为葡萄糖入血。安静时人体血乳酸的正常值小于1mmol/L。本研究中，与服用虾青素前相比，人体血浆中血乳酸水平下降(P<0.01)，表明在虾青素干预下肝肾糖异生作用加强。崔炳权[16]提出，抗氧化中药余甘子可以显著增加乳酸脱氢酶活性。而虾青素作为天然强抗氧化剂，我们认为其加速乳酸清除的原理与LDH的活性变化相似。

谷氨酸(glutamate，Glu)和谷氨酰胺(glutamine，Gln)均为生糖氨基酸，在能量代谢系统中发挥着重要作用。其中谷氨酰胺作为人体内含量最丰富的氨基酸，还参与了蛋白质合成与分解、铵的转运、免疫功能调节等生理过程[17]。在抗氧化方面，谷氨酰胺和谷氨酸是谷胱甘肽的前体物质，谷胱甘肽是机体内抗氧化应激的重要物质[18]。另外，谷氨酰胺也可以通过转化为葡萄糖胺抑制戌糖途径从而使NADPH的浓度降低进而抑制NO的合成。NO作为一种信号传递分子，在体内高氧化应激的环境下与心脏缺血-再灌注损伤密切相关[19]。服用虾青素28d使血浆谷氨酸(P<0.01)、谷氨酰胺的浓度下降(P<0.05)，可能与虾青素直接参与了自由基的淬灭、细胞无需再提供大量的谷胱甘肽有关。虾青素消除或减轻了细胞内的氧化应激环境，使谷氨酸、谷氨酰胺的需求量减少，故可检测到它们的量下降。

甘油是脂肪动员的产物之一。空腹状态下，儿茶酚胺能递质的释放量增加，包括肾上腺素(epinephrine，E)、去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)等，脂肪细胞表面含有丰富的肾上腺素能受体，通过第二信使环磷酸腺苷(cAMP)激活激素敏感性脂肪酶(hormone-sensitive lipase，HSL)，从而分解甘油三酯。甘油三酯分解产生的甘油经血液运至肝脏，肝脏细胞含有高活性的甘油激酶，可将甘油转化为磷酸二羟丙酮，随即视机体需要参与糖代谢或糖异生过程。清晨空腹时主要能量来源为脂肪的有氧氧化，必然会产生大量甘油。本研究中，与服用虾青素前相比，受试者体内甘油含量上升(P<0.05)，推测虾青素的补充使受试者体内甘油三酯分解增加，即安静状态下脂肪氧化供能的比重相对增加。关于虾青素是否改变了HSL的活性或相关甘油通道我们尚未可知，有待于进一步研究。

3.2 虾青素补充对运动后人体机能恢复的影响

运动时，人体的能量代谢、激素-神经-免疫网络、血液分布、器官状态等均发生变化。在能量供应方面，运动时能量供应效率最高的是磷酸原系统(ATP-CP)；其次是乳酸能系统；再次是糖和脂肪酸的有氧氧化系统。ATP-CP系统的输出效率可达56J/Kg·s，可维持运动6～8秒，乳酸能系统的最大输出功率约为29.3J/Kg·s，维持运动时间约为30～90秒，二者均为无氧供能系统。本研究采用急性大强度运动形式，受试者的肌肉供能系统为ATP-CP系统和乳酸能系统。运动对机体内环境的影响是巨大的，血液中许多小分子物质的含量发生了变化。

3.2.1磷酸原系统肌酸(creatine，Cr)是ATP-CP系统的重要参与物质，是肌肉能量供应系统不可缺少的一员。本实验主要供能系统为磷酸原系统。Cr和PCr在供能时被大量消耗，运动后即刻Cr的相对含量从运动前的3.16下降到1.99(P<0.01)。由于ATP-CP供能系统仅可持续供能6～8s，急性大强度运动后肌肉内的Cr几乎被耗尽。而本研究运动后即刻血中Cr的含量为1.99，并未耗竭，主要是因为本实验检测的是血液中Cr的含量，肌肉内的Cr耗竭时肝脏仍在不停合成并释放入血并运往骨骼肌。运动后1h血中Cr含量已接近安静水平，而运动后1d时血中Cr已高于安静值。我们认为这是运动后超量恢复的结果。已有研究表明，抗氧化剂对运动后肌肉损伤有一定的保护作用[20,21]，即可以通过保护肌纤维结构的完整从而抑制肌酸激酶(CK)的逸出。肌纤维内的CK可以使Cr转变为PCr，肌内Cr浓度下降，肌纤维摄取血中的Cr速度增加，血中Cr的恢复速度会因此减慢。本实验中运动后的采血点依次是即刻、1h、1d、1w，而ATP-CP系统的恢复速度又十分迅速，因此难以观察到虾青素摄入对血液中Cr恢复的影响。

3.2.2乳酸能系统乳酸(lactate，La)与运动关系密切。安静时人体的血乳酸含量很低，小于1mmol/L，而在大强度运动时，血乳酸可升至20mmol/L，重复动力性运动甚至可使血乳酸高达30mmol/L[22]。本研究中运动后即刻血乳酸水平上升了约5倍。有学者认为大强度运动时乳酸大量生成可导致肌肉内pH值下降，影响肌丝与钙离子的正常结合与转运及横桥的功能[23]。乳酸还是重要的信号分子。Trabold等[24]研究发现缺氧引起的酸化环境可以刺激大鼠受损组织再生，他们认为运动后肌肉的修复与重建过程中乳酸充当了重要的信号分子；Yang等[25]发现下丘脑腹内侧对乳酸的浓度变化较敏感，乳酸可能充当了外周组织与中枢神经之间的信号桥梁，即运动后乳酸的恢复过程也可能是中枢神经系统干预调控机体恢复的过程。本实验结果中，血乳酸在恢复期恢复得很快，与运动后即刻相比，运动后1h血乳酸下降了近三分之二，运动后1d时已完全恢复。有研究表明，摄入抗氧化剂有助于乳酸的清除[26]，因此，有理由认为虾青素的抗氧化性能在乳酸的清除过程中起到加速作用。

由于本实验中主要供能系统为磷酸原系统和乳酸能系统。葡萄糖作为乳酸的来源，血液中的葡萄糖在运动时自然大量消耗。全凯的研究认为大强度运动后血糖先降后升，运动后1h和6h，血浆葡萄糖水平仍高于安静组[27]。本实验中运动后的采血点为即刻、1h、1d、1w。由实验结果可见，运动后即刻血浆中葡萄糖含量下降，但恢复迅速，在运动后1h就已经几乎恢复到了安静时的水平。

3.2.3氨基酸代谢支链氨基酸(branched chain amino acids，BCAAs)包括亮氨酸(leucine，Leu)、异亮氨酸(isoleucine，Ile)、缬氨酸(valine，Val)。作为氨基酸的载体，它是合成骨骼肌蛋白质的原料。支链氨基酸具有十分重要的生理功能[28,29]：促进蛋白质合成；作为能源物质参与能量代谢；促进胰岛素、生长激素、胰岛素样生长因子-1( insulin-like growth factor-1，IGF-1)的产生；通过调节色氨酸与5-羟色胺的相对比例对抗大脑的中枢疲劳等。此外，支链氨基酸还有抗自由基的功效，可以维持线粒体膜免受脂质过氧化物的攻击[30]。本研究中，受试者血液中支链氨基酸的变化状况是运动后即刻显著下降。除Ile在运动后1h与即刻相比有上升趋势但无显著差异外，Val、Leu在恢复期(运动后1h、运动后1d)显著上调(P<0.01)。本实验中受试者在持续补充虾青素，使得BCAAs的利用相对节省化，这是本研究中运动后恢复期BCAAs总体上调趋势明显的影响因素。

甘氨酸(glycine，Gly)是一种非必需氨基酸，是合成谷胱甘肽、肌酸等的原料，也是一种抑制性神经递质。近年来，Gly作为运动营养补剂的研究逐渐兴起。樊晓飞等人[31]发现Gly的预先补充可以缓解一次性力竭运动后的免疫损伤，提高血浆中补体的数量，提高小鼠运动成绩，改善运动引起的细胞膜氧化损伤。这可能是因为Gly是肌酸和谷胱甘肽的合成原料，而谷胱甘肽则是一种抗氧化物质。本研究中，运动后即刻血中Gly水平几乎下降了一半，运动后1h已恢复至近运动前安静值。推测可能是虾青素发挥了作用。本研究中受试者补充了虾青素，虾青素强大的抗氧化性能对抗一部分氧化损伤，因而减少了运动后即刻受试者血液中Gly含量的进一步下降，并促进运动后1h血浆Gly几乎完全恢复。但左群等人的研究并未出现这样迅速的恢复[32]。

3.2.4脂代谢血浆脂质包括甘油三酯(triacylgcerel，TG)、磷脂、游离脂肪酸(free fatty acid，FFA)、胆固醇等。本实验中血浆总脂类在运动后即刻大幅下降(积分均值由2.65下降至1.33)，运动后1h完全恢复(积分均值上升至2.85)。运动间歇的3min时间内，机体处于高水平代谢状态，氧供充足，对血浆FFA的利用率增加，这可能是血浆脂类运动后即刻下降的主要原因。运动后1h内血浆儿茶酚胺及其它脂解激素水平相对于运动前上升[33]，通过第二信使促进作为脂肪动员唯一限速酶的HSL分解甘油三酯，水解后的FFA和甘油在血液中浓度上升。以往的研究中，无氧运动对血液中脂类物质的影响研究结果并不统一。有学者认为运动后血清中的脂蛋白水平变化与运动强度、时间、运动方式有关[34]。本研究1H-NMR检测的结果并未区分每一种脂蛋白的变化情况，只是检测到血浆总体脂类的变化情况，因此无法详细探讨在虾青素干预下每一种脂蛋白的变化情况。

肉毒碱的主要作用是促进脂肪酸β-氧化、降低血清胆固醇及甘油三脂的含量、提高机体耐受力。目前运动领域关于肉碱的研究集中于补充肉碱对有氧耐力的影响。李泱等人[35]的研究表明，长时间有氧运动后受试者血浆肉碱水平升高。本实验中，短时间大强度运动导致运动后即刻血浆肉碱水平下降(积分均值由8.09下降至4.15)，运动后1h几乎完全恢复(积分均值升至7.65)。我们认为正是因为无氧供能系统在发挥作用，因此，机体对肉碱的需求量下降，血液中肉碱水平也下降。在运动后即刻与1h之间，脂肪供能的比例上升，血中肉碱的含量随之上升。此外，有证据表明，肉碱具有抗氧化作用[36]，但对于其抗氧化的机理尚无深入研究，是否与虾青素之间有某种协同作用尚待证明。

本研究中指认出的乙酰乙酸和β-羟丁酸同属酮体，而且变化趋势基本一致：运动后即刻大幅下降，恢复期(1h、1d)逐渐恢复。张爱芳综合了不同研究结果[37,38,39]认为，相比短时间大强度运动，长时间中等强度的运动更容易出现运动后酮症的现象[40]，但这并不代表短时间大强度运动后就不会有酮体水平变化[41]；马海峰和吴瑛[42]研究了一堂混氧代谢的训练课，发现运动30分钟后运动员尿液中的β-羟丁酸含量上升。本研究中受试者的运动形式为30秒大负荷功率自行车骑行运动，主要消耗无氧供能系统提供的能量。运动后人体处于运动后过量氧耗的状态，身体代谢水平较高，在HSL的作用下，脂肪动员是加强的。此时肝细胞线粒体内的乙酰CoA水平上升，酮体的合成与分泌自然增加。由于没有检索到抗氧化剂与酮体相关文献，因此无法明确虾青素与酮体之间的关系。

3.2.5其他小分子标志物代谢目前，关于氧化三甲胺(trimethylamine oxide，TMAO)的研究多集中于动物养殖领域。近年来代谢组学的发展引起了人们对于人体内TMAO代谢的关注。TMAO的来源包括外源性直接摄入富含TMAO的鱼类等食品和肠道内菌群利用食物摄入的卵磷脂和肉碱等物质合成TMAO。动物研究的结果表明：TMAO具有维持蛋白质稳定性、减少脂肪沉积、维持细胞渗透压、抗氧化等作用。它在水产动物体内含量丰富，是其鲜味的主要来源[43]。但Wang等人[44]认为，TMAO在人体内对动脉粥样硬化的产生和发展起到促进作用。本实验中运动后即刻TMAO的含量下降，运动后1h出现明显恢复。短时间大强度运动后血乳酸水平大幅度上升，体温也相应升高，这可能与运动后即刻TMAO水平下降有关。由本实验结果可见，TMAO的恢复速度相当迅速，运动后1h已经基本恢复至安静水平。许多关于运动与代谢组学的研究均发现TMAO与运动之间存在联系[41,42,45]。TMAO可能是运动中的重要潜在代谢标志物。关于其在人体内的产生、代谢、抗氧化等方面的研究尚有大量工作有待进行。

甜菜碱(Betanine)是一种甲基供体，可用于合成脂酰胆碱、半胱氨酸、肉碱等物质。补充甜菜碱对人体健康的影响有[46,47]：降低血脂；保护肝脏；增强妊娠营养；维持渗透压；与心血管疾病和肿瘤的治疗可能也存在某些关系[48,49]。Armstrong等[50]的研究表明，补充甜菜碱可以提高运动成绩，这可能与甜菜碱维持渗透压的作用相关。本实验中，受试者运动后即刻血液中的甜菜碱水平下降(平均积分值由14.46下降至8.76)，运动后1h与运动后1d上升(运动后1h平均积分值上升至12.45，运动后1d上升至13.54)，可能是因为在运动间歇时间里，受试者处于高代谢水平，肉碱、肌酸等物质都在大量合成，需要大量的甲基，血液中的甜菜碱作为甲基供体被大量消耗，所以大幅下降。而运动后随着代谢水平的下降，甜菜碱的水平也逐渐恢复。目前，未检测到甜菜碱与虾青素相关的研究报道。

3.2.6运动后1d与运动后1w模型不成立原因探讨本次研究的结果中，E5组和E6组经多次分析尝试，模型不成立，即运动后1d和运动后1w无法正常分析。其原因有：组间差异过小或组内差异过大。笔者比较倾向于第一种情况。经查阅文献，急性大强度运动后1d机体的免疫指标已经完全恢复[32,51]，纹状体、中脑、下丘脑的单胺类神经递质和运动前相比无差异[52]，抗氧化系统也已完全恢复[53]。在实验中，多数差异物在运动后1d已经非常接近或达到运动前水平，这可能是模型无法成立的原因。当然，也不排除由于样本处理出现问题或人数过少等原因导致的第二种情况。需要下次做实验时增加受试者数目以及严格采集样本来解决。