转录因子Runx2对人乳腺癌MDA-MB-231细胞上皮-间充质转化能力的影响*

张 萍， 何晓刚， 徐晓丹， 张 露， 刘 雪， 刘亚坤， 姜 玉， 汪思应， 李菲菲△

(1安徽医科大学基础医学院， 安徽 合肥 230032； 2上海健康医学院附属周浦医院， 上海 201318)

乳腺癌是影响全球女性最普遍的肿瘤之一，乳腺癌远处转移引起显著的病死率[1]。据统计，2015年美国报告的女性浸润性乳腺癌病例数为231 840例，其中40 290例死亡[2]。乳腺癌侵袭性转移的机制有很多，但近期大多数研究结果表明，在乳腺癌的侵袭性转移过程中乳腺癌细胞上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)起重要作用[3-5]。肿瘤细胞发生EMT时细胞形态由上皮细胞形态变成梭形间充质细胞形态，细胞与细胞之间的黏附和极性丧失，并且伴有上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)表达降低，神经型钙黏蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(vimentin)表达增加，迁移和侵袭能力增加，加强了原发肿瘤的传播[6]。肿瘤细胞EMT的发生是由细胞、分子和肿瘤微环境共同参与的过程，不同的信号通路如转化生长因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)、Notch和Wnt信号均可诱导EMT,它们的活性影响EMT相关转录因子的表达[7]。大量证据表明乳腺癌是一种侵袭性肿瘤，具有较高的EMT相关的转移能力[8],探讨EMT的发生机制对于了解乳腺癌侵袭转移机制具有重要作用。

Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2，Runx2)是一种成骨细胞和骨组织形成的关键转录因子[9],它通过结合成骨细胞特异性元件2(osteoblast-specific element 2，OSE2)调控几种与骨基质重建有关基因的表达[10-11]。Runx2及其靶基因在乳腺癌组织中高度表达，并且在乳腺癌骨转移中起着重要作用[12]。由于肿瘤的转移是一个源于EMT使肿瘤细胞从其起源部位形成多步骤的扩散过程，而EMT的发生使上皮细胞失去与周围环境的联系并获得一种间充质表型, 协助肿瘤细胞从起源部位进入血液循环并迁移到远处的器官[13-14]，那么Runx2是否能够通过发生EMT使得乳腺癌细胞突破基底膜、定植到骨，从而引起乳腺癌的骨转移？为了明确Runx2与乳腺细胞EMT的关系，我们用RNA干扰技术建立了稳定敲减Runx2表达的高侵袭转移性乳腺癌细胞系MDA-MB-231，观察比较了该细胞株的EMT相关表型和细胞侵袭转移能力的改变，现将研究结果报告如下。

材 料 和 方 法

1 主要细胞、试剂

人乳腺癌细胞株MDA-MB-231由美国合作实验室引进,用含10%胎牛血清的DMEM培养基(Gibco)培养。Runx2 RNA干扰慢病毒(上海吉凯基因化学有限公司)；胎牛血清(天津康源生物技术公司)；嘌呤霉素(Sigma)；TRIzon Reagent(康为世纪生物科技有限公司)。PCR扩增仪(Biometra)；荧光倒置显微镜(ZEISS)；细胞培养箱和酶标仪(Thermo)；琼脂糖凝胶电泳仪(Bio-Rad)；凝胶成像仪FluorChem(上海晶檀生物有限公司)。

2 主要方法

2.1Runx2基因RNA干扰慢病毒载体的构建及包装 由上海吉凯基因化学技术有限公司以 GV248 为载体，根据人Runx2 基因序列(NM_001024630) 设计并合成3条靶向短发夹RNA (short hairpin RNA，shRNA) 序列 [shRNA1 (5’-TACCTATCACAGAGCAATT-3’)、shRNA2 (5’-CAGTGATTTAGGGCGCATT-3’)和shRNA3 (5’-GCACTCCATATCTCTACTA-3’)]及1条阴性对照(control)shRNA序列(5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’)，并以此构建并包装3种慢病毒载体及空载慢病毒载体。

2.2慢病毒感染 感染前一天将正常对数生长期的MDA-MB-231细胞用1 mL 0.25%胰蛋白酶消化1 min后，离心，计数，按每孔细胞以5×104个接种于24孔板中，当细胞融合度达到45% 时开始病毒感染。病毒的MOI值为10(病毒滴度为1×107)感染效果最佳。弃去原培养基，将440 μL DMEM+10 μL Runx2-shRNA+50 μL polybrene加入1.5 mL EP管混匀后加入相应的孔中。12 h后，将培养基换成含10% 胎牛血清的DMEM培养基。培养72 h后，荧光显微镜下观察细胞荧光表达。接着用浓度为0.5 mg/L的嘌呤霉素筛选，挑单个细胞克隆，进行扩大培养，建立低表达Runx2的稳定的MDA-MB-231细胞系。

2.3基因表达检测 RT-PCR检测稳定敲减Runx2表达的MDA-MB-231细胞中Runx2的mRNA表达水平。Runx2的上游引物序列为 5’-CCGGAATGCCTCTGCTGTTATGA-3’，下游引物序列为5’-ACTGAGGCGGTCAGAGAACAAACT-3’(238 bp)；β-actin的上游引物序列为5’-ACTGGTCTCAGTCAGTGTACAGC-3’，下游引物序列为5’-ACAGGAAGTCCCTTGCCATC-3’。对数生长期细胞弃去原培养基，每小皿加入1 mL TRIzon Reagent，枪头反复吹打裂解细胞后移入1.5 mL EP管,分次加入氯仿、异丙醇和75% DEPC无水乙醇，提取RNA。取适量RNA进行逆转录，逆转录体系为:template RNA 3 μg，Oligo (dT) prime 1 μL，加入DEPC水至总体积为12 μL;混匀，金属浴65 ℃ 5 min后，加入5×reaction buffer 4 μL、RiboLock RNase inhibitor(20 U)1 μL、10 mmol/L dNTP Mix 2 μL和RevertAid M-MuLV RT (200 U) 1 μL，混匀，总体积为20 μL。反应条件为：42 ℃ 60 min、70 ℃ 5 min。PCR体系为：2×Es Taq MasterMix 12.5 μL， 1×forward primer 1 μL, reverse primer 1 μL, template DNA 2 μL, DEPC水 8.5 μL，总体积25 μL。反应条件为：预变性 94 ℃ 2 min;变性 94 ℃ 30 s，退火 58 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 30 s，30个循环，终延伸 72 ℃ 2 min。取PCR产物进行凝胶电泳，凝胶成像仪拍片，计算不同条带灰度值，不同组间进行比较。

2.4Western blot检测Runx2和EMT相关蛋白的表达 收集对数生长期细胞，RIPA裂解提取总蛋白、SDS-PAGE分离及转膜、封闭及 I 抗(1∶1 000)孵育过夜、次日TBST洗膜3次，每次10 min,再加入II 抗(1∶5 000)，摇床上室温孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。化学发光检测，并测定灰度值。

2.5细胞侵袭实验 实验前进行细胞饥饿处理12 h。提前将基质胶于冰上融化成液态，将150 μL无血清的DMEM培养基和50 μL的基质胶混匀。每个小室上室均匀铺30 μL稀释的基质胶后，将小室置于24孔板里于孵箱中30 min，使胶凝固。取处于对数生长期的细胞，胰酶消化并离心，制成单细胞悬液，调整浓度至1×109/L。待小室的胶凝固后，每组细胞设2个复孔，每孔3×105cells，小室上室无血清的DMEM培养体系每孔200 μL，加入相应体积的细胞悬液，下室加500 μL完全的DMEM培养基。将24孔板置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h后，收板。弃去上室培养液，棉签轻擦去上室中未穿过膜的细胞。加4%多聚甲醛结晶紫固定并染色2 h后。PBS清洗上室3次，室温干燥后，显微镜下观察、拍摄图片，每孔随机选取5个视野拍照并计数。实验重复3次。

2.6软琼脂集落形成实验 实验前将水浴锅设置为60 ℃(维持琼脂糖胶呈液态)，按1∶1比例使1.2%的琼脂糖和2×DMEM完全培养基(含20% 胎牛血清和2%青、链霉素)充分混合制备下层胶，每孔取1.5 mL铺于6孔板中(枪头稍留点，不全打完，避免产生气泡)，封口膜封板，于平整冰面上冷却凝固(约45 min)。在等待下层胶凝固的时间中，取对数生长期的细胞，胰酶消化离心，制成细胞悬液，调整细胞浓度至1×107/L。铺上层胶,每孔3 000 cells，每组细胞设2个复孔，取900 μL细胞悬液加入到600 μL 2×DMEM完全培养基中混匀，再加1.5 mL 0.7%的琼脂糖，充分混匀后取1 mL后注入铺有1.2%琼脂糖底层平皿中。冷却凝固后，加入1 mL DMEM完全培养基，保持琼脂的湿润度。置入37 ℃、5% CO2培养箱中培养14 d。收板，显微镜下观察、拍摄图片，每孔随机选取5个视野拍照并计数。实验重复3次。

3 统计学处理

用SPSS 16.0统计软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示。多组间比较采单因素方差分析(one-way ANOVA)，用Bonferroni 校正的t检验进行各组间均数的两两比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 成功建立Runx2表达抑制的乳腺癌细胞系

慢病毒转染72 h后，在荧光显微镜下观察细胞荧光表达，并用嘌呤霉素筛选2～3周，直至荧光倒置显微镜下观察所有的细胞均能够稳定表达GFP荧光时，说明成功建立了稳定敲低Runx2表达的细胞株，见图1。敲低Runx2表达的MDA-MB-231乳腺癌细胞株(Runx2-shRNA3)中Runx2的mRNA和蛋白含量明显低于常规MDA-MB-231乳腺癌细胞和转染慢病毒阴性载体的MDA-MB-231乳腺癌细胞(P<0.05)，提示在本实验中 Runx2-shRNA3组干扰效率好，并应用于后续实验中；未转染(control)组和阴性对照(NC)组的差异无统计学显著性，见图2。

2 敲减Runx2表达抑制乳腺癌细胞EMT过程

与正常MDA-MB-231细胞相比，敲减Runx2表达的MDA-MB-231细胞呈多边形，细胞之间变得更加紧密，呈现上皮样改变,这一现象提示敲减MDA-MB-231细胞中Runx2的表达可能抑制EMT过程，促使细胞发生间充质细胞上皮化，见图3A;随后我们采用Western blot检测不同组中EMT相关标志物 E-cadherin、N-cadherin、β-catenin和基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)的蛋白表达，结果显示敲减Runx2表达的MDA-MB-231细胞中E-cadherin蛋白明显高于常规MDA-MB-231细胞和转染慢病毒阴性载体的MDA-MB-231细胞(P<0.05)，未转染组和阴性对照组的差异无统计学显著性，见图3B;敲减Runx2表达的MDA-MB-231细胞的N-cadherin、β-catenin和MMP-9蛋白水平明显低于常规MDA-MB-231细胞和转染慢病毒阴性载体的MDA-MB-231细胞(P<0.05)，未转染组和阴性对照组的差异无统计学显著性，见图3B。

Figure 1.Knock-down ofRunx2 expression by lentiviral vector infection in MDA-MB-231 cells (×200).

图1建立稳定表达GFP荧光的乳腺癌细胞系

Figure 2.The mRNA and protein expression of Runx2 with or without infection with lentiviral vector in MDA-MB-231 cells detected by RT-PCR and Western blot. A: the mRNA expression of Runx2 was obviously inhibited in Runx2-shRNA3 group; B: the protein expression of Runx2 was obviously inhibited in Runx2-shRNA3 group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group and NC group.

图2成功建立Runx2表达抑制的乳腺癌细胞系

Figure 3.Mesenchymal-to-epithelial transition of MDA-MB-231 cells after down-regulating the expression ofRunx2. A: the cell morphological changes were observed under reverted microscope (×200); B: the relative protein expression of Runx2 and the EMT markers E-cadherin, N-cadherin, β-catenin and MMP-9 in the MDA-MB-231 cells detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group and NC group.

图3Runx2低表达抑制乳腺癌细胞EMT过程

3 抑制Runx2表达可以抑制高侵袭转移性乳腺癌细胞的侵袭能力

通过以上研究我们发现，下调Runx2的表达可致MDA-MB-231细胞的EMT也受到抑制，因此我们进一步检测了敲减Runx2表达后细胞的侵袭转移能力是否也受到了抑制。通过细胞侵袭实验，我们发现敲低Runx2表达的MDA-MB-231细胞与正常MDA-MB-231细胞相比，侵袭能力明显下降(P<0.05)，未转染组和阴性对照组的差异无统计学显著性，见图4A，说明抑制Runx2表达可以抑制高侵袭转移性乳腺癌细胞的侵袭能力。

通过软琼脂集落形成实验，我们检测了敲减Runx2表达后细胞的非锚定生长能力，发现敲减Runx2表达的MDA-MB-231细胞与正常MDA-MB-231细胞相比，细胞形成集落的数目以及体积明显降低(P<0.05)，未转染组和阴性对照组的差异无统计学显著性，见图4B,说明抑制Runx2表达可以抑制高侵袭转移性乳腺癌细胞的非锚定生长能力，降低了肿瘤细胞的恶性生物学行为，进而影响了肿瘤细胞侵袭转移能力。

讨 论

Runx2是属于Runx基因家族的转录因子，有一个保守的Runt DNA 结合域，编码与果蝇同源的蛋白[15]。最初，Runx2被认为是骨骼发育的一个主要的调节因子[16]。迄今为止，大量的证据表明Runx2和乳腺癌转移密切相关[17]。Runx2高表达于更倾向骨转移的乳腺癌细胞系和乳腺原发组织中[18-19]。有证据表明在乳腺癌细胞中，Runx2能够调节与骨转移有关的基因和基质金属蛋白酶的表达，促进乳腺癌降解细胞基质，破坏基底膜侵入血管或淋巴管，有利于肿瘤细胞在远处转移部位的定植[20-21]。而上皮间充质化是恶性肿瘤进展过程中肿瘤获得浸润、迁移和远处转移能力的重要机制[22]。EMT的发生是上皮细胞通过复杂的细胞和微环境改变获得间充质表型，比如上皮标志物的降低，间充质样标志物的表达上调，细胞骨架的重组和基底膜的降解导致细胞间连接丢失，从而促进这些细胞的侵袭和运动能力[3]。

Figure 4.Inhibition ofRunx2 expression decreased the invasion ability of high invasive metastatic breast cancer MDA-MB-231 cells. A: the invasion ability of MDA-MB-231 cells was inhibited afterRunx2 expression knock-down; B: inhibition ofRunx2 expression inhibited anchorage-independent growth of human breast cancer MDA-MB-231 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group and NC group.

图4抑制Runx2表达可以抑制高侵袭转移性乳腺癌细胞的侵袭能力

因此，我们推测Runx2除了对肿瘤相关转移骨定植和基底膜突破发挥作用外，是否能够参与肿瘤细胞诱导EMT的发生，从而最终影响细胞的侵袭和转移能力。

本研究中我们选取Runx2表达水平较高的MDA-MB-231细胞，转染敲减Runx2表达的慢病毒载体。通过Western blot和RT-PCR验证了Runx2的敲减效率，结果显示敲减Runx2表达的MDA-MB-231细胞中上皮标志物E-钙黏蛋白被诱导，间充质标志物N-钙黏蛋白被明显抑制，降解细胞基底膜的蛋白酶MMP-9被抑制，参与诱导EMT的经典WNT信号通路的β-catenin蛋白表达被抑制。这些结果表明敲低Runx2的表达能够抑制EMT。同时我们通过侵袭实验和软琼脂集落形成实验结果显示，干扰Runx2可抑制细胞EMT的过程，从而抑制了细胞的侵袭转移能力。我们的研究提示，抑制Runx2的表达可以有效地干扰侵袭性较高的乳腺癌细胞的EMT过程，从而对乳腺癌细胞的侵袭能力起到抑制作用。但Runx2通过转录激活下游何种蛋白来影响EMT的过程仍在进一步研究中，我们初步的研究结果发现这一过程可能与一种重要的细胞因子——TGF-β有关，相关实验仍在进行中。本研究为今后以Runx2为核心，发现有效治疗靶点，干预乳腺癌的侵袭和转移提供了重要的思路和研究方向。