水产动物主要致病弧菌多重PCR检测方法的建立与应用

成翔宇 冯春明 马红丽 李 华 叶仕根

大连海洋大学/ 农业农村部北方海水增养殖重点试验室，辽宁大连116023

溶藻弧菌（V. alginolyticus）、副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）、创伤弧菌（V. vulnificus）是3 种常见的水产动物病原菌，3 种弧菌均可感染鱼类、甲壳类、贝类等多种水产动物[1]，能引起鱼类体表出血、皮肤溃疡、肠炎以及对虾的红腿、肠炎等症状[2]。由于这3 种弧菌所引起的水产动物感染有诸多相似之处，难以通过症状确诊，多重PCR 技术具有较高的特异性和灵敏度，而且可以同时检测多种病原，是一种高效且简便的检测方法。目前用于弧菌多重PCR 检测的靶基因大多是看家基因gyrB、toxR、rpoS 等，或毒力基因flaE、vvh、胶原酶基因等[3]，因为不同种弧菌中基因序列不同，在同种弧菌中表现差异较小。然而，随着养殖规模和地域的扩大以及保育物种增加等因素，近年来新型菌株的不断出现，Kemp 等[4]发现弧菌会在患有白斑病的鹿角珊瑚（Acropora palmata）的病灶中快速增殖。新发现的菌株的基因型与以往菌株不同，这就可能导致原来用于多重PCR 的特异性引物丧失其特异性。为了准确地检测致病弧菌，本试验选取溶藻弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌的不同目的基因的引物，在验证它们特异性的基础上进行了多重PCR 反应体系和条件的优化，并通过人工感染大菱鲆验证多重PCR 的检测效果。

1 材料与方法

1.1 试验材料

弧菌标准菌株及分离株16 株（实验室保存，宁波大学王国良老师惠赠，大连海洋大学王斌老师恵赠）、试验用鱼（大连某海水养殖场)、合成的引物（根据文献[5-6]，提交上海生工合成）。

1.2 试验设计

采用抽提法[7]和水煮法进行DNA 模板的制备，根据用于检测溶藻弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌的引物，选取退火温度相似、特异性较强、由不同目的基因设计的引物，提交上海生工合成。制备好的DNA 模板进行PCR 检测并观察其结果，再以溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌的DNA 混合物为模板，对多重PCR 反应条件进行优化及灵敏度的测定。最后将3 种菌等浓度混合后腹腔注射感染大菱鲆，注射剂量为0.1 mL/尾，每组10 尾；空白对照组10 尾，注射相同剂量的灭菌生理盐水。感染后分别于0.5、2、4、10、24 h 无菌操作取肝脏和肾脏组织各0.1 g，分别进行单重PCR 和多重PCR 检测。

2 结果与分析

2.1 引物的特异性

3 种弧菌的9 对引物中，有3 对具有较强的特异性（表1）。

2.2 多重PCR 反应条件优化

由图1 可知，最终选择58 ℃作为退火温度，后续的试验均在此基础上进行多重PCR 反应；由图2可知，最终引物的浓度确定为溶藻弧菌的引物浓度为4 pmol/μL，副溶血弧菌的引物浓度为5 pmol/μL，创伤弧菌的引物浓度为2.5 pmol/μL；由图3 可知，当Mg2+为2.0 mmol/L时可得到均一稳定、清晰的扩增条带。

表1 3 对较强特异性引物

图1 副溶血弧菌、溶藻弧菌和创伤弧菌的多重PCR温度梯度试验

图2 副溶血弧菌、溶藻弧菌和创伤弧菌引物浓度梯度多重PCR 扩增结果

2.3 多重PCR 的灵敏度

在上述优化的反应条件下，多重PCR 对溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌的灵敏度分别为102、102和103CFU/mL。

图3 副溶血弧菌、溶藻弧菌和创伤弧菌Mg2+浓度梯度多重PCR 扩增结果

2.4 人工感染大菱鲆的多重PCR 检测

将3 株菌注射到大菱鲆腹腔内后，分别取大菱鲆的肝脏和肾脏0.1 g 进行组织匀浆后，使用2 种提取方法提取DNA，阴性对照组的大菱鲆注射灭菌生理盐水，检测结果见表2。

表2 混合感染试验鱼体多重PCR 检测结果

3 讨 论

致病弧菌（以下简称“弧菌”）给水产养殖业造成的危害严重，不同弧菌的流行病学特征类似，有时还会发生混合感染，因此，弧菌的检测技术对弧菌的防治至关重要。PCR 技术近年来被广泛用于各种细菌的检测，但是常规的PCR 一次只能检测1 种细菌，效率较低，而多重PCR 是一种可同时检测多种弧菌的良好方法。

特异性高的PCR 是基于检测对象的特异性基因，最常用的是利用16S rRNA 基因鉴定细菌，但是由于该基因具有高度保守性，只依靠16S rRNA 不能准确鉴定到种。Kita-Tsukamoto 等[8]对副溶血弧菌和溶藻弧菌的16S rRNA 序列进行了分析，认为二者的相似性大于99%。因此，许多学者开始了弧菌的毒力基因序列或看家基因序列的研究，发展了许多以这些基因为基础的弧菌的PCR 检测方法[6]。多重PCR 虽然可以同时检测多种基因，但是由于体系中包含多对引物，容易出现非靶基因交叉扩增。flaE、vvh 和胶原酶基因均为弧菌毒力基因，经常被用于各种弧菌的检测，Tarr 等[9]利用flaE 基因鉴定副溶血弧菌，特异性良好；徐义刚等[10]以flaE 基因为靶基因，建立了溶藻弧菌的LAMP 检测方法。本研究证明，通过上述3 个基因的特异性引物建立的溶藻弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌多重PCR 检测法不与其他细菌发生交叉反应，灵敏度约为102～103CFU/mL。Yin等[11]建立的多重降落PCR 方法检测创伤弧菌的灵敏度为104CFU/mL，对溶藻弧菌和副溶血弧菌的灵敏度为103CFU/mL，由此可见，本研究的多重PCR 检测法灵敏度较高。

为了接近养殖生产实际，实验室采用多重PCR检测3 种弧菌的标准菌株感染大菱鲆的组织匀浆液。本试验对组织匀浆液中5 种致病菌的最低检测浓度都小于或约等于1.0×104CFU/g。据靳素英等[12]报道，当水中弧菌浓度为104时，是发病临界菌量；弧菌浓度为105时，就可能导致弧菌病产生[13]。本研究对组织匀浆液中的致病菌检测的灵敏度低于这个阈值，而且多重PCR 的检测结果与单重PCR 基本相同，说明本研究建立的多重PCR 检测方法在实际生产中用于致病菌的检测是完全可行的。综上所述，本研究建立的溶藻弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌多重PCR 检测法特异性强、灵敏度高，而且方便快捷，有望成为实际生产中检测致病弧菌的有效手段。