精子线粒体DNA 4 977bp片段缺失与男性不育相关性研究∗

盛礼建 王巧刚 王巧燕

浙江省东阳市人民医院 322100

在男性不育患者中，弱精子症或精子无力症约占19%，已成为男性不育的主要病因之一[1]。细胞中进行有氧氧化的主要细胞器是线粒体，其通过有氧氧化为细胞各项生命活动提供能量。在男性生殖中，线粒体通过氧化磷酸化为精子运动提供能量基础。科学研究显示，精子活力下降与线粒体基因的缺失和突变有一定的相关性[2]。本实验旨在寻找精子运动情况与mtDNA 缺失的相关性，在分子水平上寻找男性不育的原因，为该病的诊断和治疗提供相应的科学依据和研究方向。

1 资料与方法

1.1 样本收集 选取2017年1—12月我院生殖中心因男性不育就诊的患者，年龄25～38岁，平均年龄32岁，有3～5年不育病史，其配偶妇产科检查正常，弱精子症患者诊断参照WHO标准：a级<25%且a+b级精子<50%，共100例作为观察组。同时，选取在东阳市人民医院生殖中心因女性不孕就诊的健康男性，年龄25～38岁，平均年龄31.5岁，精液常规检查正常，精子活力正常，a级>25%且a+b级精子>50%样本，共100例作为对照组。两组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。以上样本均在禁欲3～5d后，用手淫法留取，37℃恒温水浴箱内30min内液化后进行分析。

1.2 方法

1.2.1 精子DNA的制备：精子样本用血细胞基因小量制备试剂盒提取精子总DNA，紫外分光光度计定量分析。

1.2.2 根据正式发表的mtDNA全序列，设计两对PCR扩增引物，委托由上海生物工程公司合成。总mtDNA(大小533bp)其扩增用的引物序列是：

上游引物F1 5’-AACATACCCATGGCCAACCT-3’；

下游引物R15’-GGCAGGAGTAATCACGGTCA-3’。

mtDNA 4 977bp缺失(大小524bp)其扩增用的引物序列是：

上游引物F2 5’-CCGGGGGTATAGACGGTCA-3’；

下游引物R2 5’-GCGGAAGCGAGGTTGACCTG-3’。

PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min，56℃退火50s，72℃延伸1min，32个循环，最后72℃延伸7min；PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.3 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件进行处理分析，计数资料以率(%)表示，组间比较采用χ2检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 总mtDNA以及4 977bp片段缺失的mtDNA琼脂糖凝胶电泳结果分析 以提取的DNA为模板，通过上游引物F1 5’和下游引物R1 5’进行扩增获得总mtDNA，凝胶电泳图显示扩增出大小为533bp的条带，最终经测序确认；以F2 5’为上游引物和R2 5’为下游引物对4 977bp片段缺失的mtDNA扩增，凝胶电泳图显示扩增出大小为524bp的条带，最终经测序确认，具体见图1。证明精子DNA提取方法以及总mtDNA和4 977bp片段缺失的mtDNA和扩增引物设计合成可靠。

图1 总mtDNA和4 977bp片段缺失的mtDNA凝胶电泳结果

注：1：4 977bp片段缺失的mtDNA，2：总mtDNA，3：DNA marker。

2.2 mtDNA4 977bp缺失结果统计分析 在100例弱精子症患者(观察组)中，扩增出mtDNA 4 977bp缺失扩增产物的有64例，缺失率高达64%；而在100例精子活力正常标本(对照组)中，扩增出mtDNA 4 977bp缺失扩增产物的只有6例，缺失率仅为6%；两组间比较，差异具有明显的统计学意义(χ2=73.934，P<0.01)。

3 讨论

目前，随着工业高速发展，人们生活节奏的加快，工作压力的增加，不孕不育正逐渐成为全世界生殖健康一个共同的问题。流行病学研究表明，不发达国家育龄期夫妇不孕不育率在9%～30%之间，而在发达国家也有约15%[3]；导致不孕不育的病因中，由男性因素导致的不育为30%～50%[4]。导致男性不育的因素有很多，弱精子症是导致男性不育的主要因素之一。导致弱精子症的病因众多，包括染色体异常、精索静脉曲张、免疫、感染、内分泌等多种因素，此外没有明确病因的大约占到10%。通过弱精子症的分子机制研究表明，精子活力低下，甚至是成年男性不育受到精子核基因组以及线粒体基因组突变的影响。Holyoake等[5]研究发现线粒体基因位点9055和11719突变频率与精子活力表现出一定的负相关性。通过对精子线粒体基因组以及精子线粒体的研究表明，通常在弱精子症患者中，异常线粒体如线粒体粘连、缺损、小线粒体等具有较高的比例，而在精子活力正常者中异常线粒体比例较低。在mtDNA的突变率方面，弱精子症患者也与正常人群间存在显著性差异，其突变率明显高于精子活力正常者。发生在mtDNA上的大片段缺失或点突变往往会影响线粒体蛋白质的正常功能，导致氧化磷酸化功能障碍，ATP生成不足，最终导致男性精子活力不足。

研究发现在不育症患者中，尤其是精子活力减低的患者中存在大量mtDNA缺失现象[6-11]。Kao等[12]研究发现，在活力低下精子中发生大片段缺失的概率显著高于正常活力精子。Ieremiadou等研究表明，精子mtDNA 4 977bp缺失与精子活力及精子受精能力呈负相关，提示4 977bp缺失可能是弱精子症的病因之一。mtDNA 4 977bp位点的缺失和其他类型突变将减少mtDNA 编码的氧化磷酸化相关蛋白的合成，从而影响ATP的合成，导致精子活动能量供应不足，继而引起弱精子症和不育症。本文对100例弱精子症不育患者的mtDNA 4 977bp缺失检测发现，高达64例有mtDNA 4 977bp的缺失，而100例精子活力正常的对照样本中，只有6例检测出mtDNA 4 977bp缺失，两组间显示出明显的差异性(P<0.01)，提示mtDNA 4 977bp缺失与弱精症的发生有一定的负相关性。

综上所述，mtDNA 缺失特别是mtDNA 4 977bp缺失与男性不育呈现出一定的负相关性，本研究为今后从分子水平研究弱精症以及男性不育的发病机制提供了一定的科学依据，为男性生殖的研究指点了一定的方向。