地黄炮制过程中毛蕊花糖苷含量动态研究

单国顺,赵启苗,李 睿,高 陆,鞠成国,贾天柱*

(1.辽宁中医药大学 药学院,辽宁 大连116600；2.辽宁中医药大学 杏林学院,辽宁 沈阳110167；3.天津市滨海新区中医医院 药学科,天津300457；4.修正药业集团股份有限公司,吉林 长春130000)

地黄是玄参科植物地黄(Rehmannia glutinosa Libosc h.)的干燥块根,具有清热凉血、养阴生津的功效。熟地黄为生地黄经蒸制所制成的加工品,功效为滋阴补血、益精填髓。2015版《中国药典》中规定地黄的质量控制指标为环烯醚萜苷类成分梓醇和苯乙醇苷类成分毛蕊花糖苷。然而,由于环烯醚萜苷类成分的热稳定性较差,使其多在地黄蒸制的过程中损失殆尽。因此,2015版《中国药典》中仅保留毛蕊花糖苷的含量作为熟地黄的质量控制指标[1]。毛蕊花糖苷(verbascoside)又名阿克苷、麦角甾苷、洋丁香酚苷,作为一个苯丙素苷化合物,其具有很强的抗炎、抗氧化作用,并可调节骨代谢、生殖系统及消化系统的功能[2-4],这些作用也均与地黄生制品的“滋阴”作用相一致。然而,有研究[5,6]表明,地黄经蒸制后毛蕊花糖苷的含量会发生明显降低。那么,为了提高熟地黄的质量和临床疗效,有必要搞清楚在地黄炮制过程中有哪些因素影响了毛蕊花糖苷的含量,以便进一步提高其在熟地黄中的含量,从而为临床提供真正“质优效确”的熟地黄饮片。在本研究中,笔者采用HPLC法分析了熟地黄炮制时间、加工方式等因素对毛蕊花糖苷含量的影响情况,以期为高含量毛蕊花糖苷地黄饮片的炮制提供一定的实验依据。

1 实验材料

1.1 仪器

日本岛津公司LC-20AB液相色谱仪(LC-20AB泵,CTO-20A柱温箱,SIL-20A自动进样器,CBM-20A数据转换器)；LC-Solution色谱数据工作站；METTLER AE240型十万分之一分析天平(瑞士METTLER)；FA1004B电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；X/WT数显调节仪电热恒温水浴锅(余姚市显星仪器有限公司)；电热恒温干燥箱(上海市跃进医疗器械一厂)。

1.2 药材与试药

地黄鲜品采自河南武陟县,经辽宁中医药大学中药鉴定教研室翟延君教授鉴定为玄参科植物地黄Rehmannia glutinosaLibosch.的新鲜块根,采挖后洗净泥砂,60℃干燥,制成生地。辅料黄酒购自绍兴舜丰酿酒有限公司,批号：20160507。

毛蕊花糖苷对照品(四川省维克奇生物科技有限公司,批号wkq16062004,经HPLC测定纯度大于98%)；乙腈为色谱纯,水为纯净水,其余试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 样品制备

称取生地黄饮片及个子各1 000 g,按照每100 kg药材加40 kg水的比例进行回润,回润后的地黄饮片及个子分别留样100g,并于60℃干燥,得样品S0和T0。剩余样品分为两份,一份于高压锅内采用高压蒸制,蒸制4 h,并于60℃干燥,得样品S1和T1；另一份置蒸锅内常压蒸制,并分别于4、8、12、24、36 h取样,切厚片(个子),60℃干燥,即得样品S2(T2)、S3(T3)、S4(T4)、S5(T5)、S6(T6)。

2.2 毛蕊花糖苷含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱为WelchXtimateC18(4.6 mm×250 mm,5μm),柱温：35℃,流速：1.0 m L·min-1,PDA检测器,检测波长：334 nm,流动相：0.1%醋酸水-乙腈(82∶18),进样体积：20μL。详细色谱见图1。

2.2.2 对照品溶液制备 取毛蕊花糖苷对照品适量,精密称定,置于25 m L量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,制成每1 m L含0.22mg毛蕊花糖苷的对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液制备 取地黄、熟地黄样品粉末约2.0 g,精密称定,置于具塞锥形瓶中,精密加入甲醇100m L,称定重量,加热回流提取0.5 h,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,精密量取续滤液50 m L,浓缩至近干,残渣加流动相溶解,转移至10 m L容量瓶中,并用水稀释至刻度线,摇匀,用0.45μm微孔滤膜过滤,取续滤液,即得。

图1 HPLC 色谱

2.2.4 线性关系考察 分别精密吸取毛蕊花糖苷对照品溶液1、2、5、10、20、40μL,按照“2.2.1”项下色谱条件测定,以对照品进样量(μg)为横坐标X,峰面积为纵坐标Y,绘制标准曲线。结果线性回归方程为Y=1494100X+18715(r=0.9999),表明毛蕊花糖苷在0.22～8.8 g·L-1浓度范围内与其峰面积具有良好的线性关系。

2.2.5 精密度试验 取上述对照品溶液,在“2.2.1”项色谱条件下连续进样6次,每次10μL,记录各自峰面积,结果毛蕊花糖苷峰面积的RSD为0.61%,表明仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性试验 取熟地黄供试品溶液,室温放置,分别于0、2、4、8、12、24h进样分析,每次20μL,记录各自峰面积,毛蕊花糖苷峰面积的RSD为0.89%,表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.7 重复性试验 取同一熟地黄样品粉末6份,按“2.2.3”项方法制备供试品溶液,按“2.2.1”项下色谱条件进行分析,结果毛蕊花糖苷含量的RSD为0.71%,表明本法重复性良好。

2.2.8 加样回收率试验 取已知含量的熟地黄(毛蕊花糖苷含量0.256 mg·g-1)6份,每份约1.0g,精密称定,置于具塞锥形瓶中,各加入毛蕊花糖苷对照品溶液1 m L,按“2.2.3”项方法制备供试品溶液,在“2.2.1”色谱条件下进样分析,计算毛蕊花糖苷的回收率,结果平均回收率为99.41%,RSD为1.48%,说明该方法准确可靠。详见表1。

2.2.2 对照品溶液制备 取毛蕊花糖苷对照品适量,精密称定,置于25 m L量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,制成每1m L含0.22 mg毛蕊花糖苷的对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液制备 取地黄、熟地黄样品粉末约2.0g,精密称定,置于具塞锥形瓶中,精密加入甲醇100 m L,称定重量,加热回流提取0.5 h,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,精密量取续滤液50 m L,浓缩至近干,残渣加流动相溶解,转移至10 mL容量瓶中,并用水稀释 至刻度线,摇匀,用0.45μm微孔滤膜过滤,取续滤液,即得。

表1 毛蕊花糖苷加样回收率试验结果

3 结果

分别取生地黄饮片、样品S0、S1、S2、S3、S4、S5、S6、地黄个子、T0、T1、T2、T3、T4、T5、T6,按照“2.2.3”项下方法制备供试品溶液,每批平行3份,精密吸取各供试品溶液各20μL,注入高效液相色谱仪测定,记录各峰面积,并以外标法计算毛蕊花糖苷的含量。结果见表2。

表2 生地黄、不同工艺熟地黄中毛蕊花糖苷含量测定结果

4 讨论

本文所建立的毛蕊花糖苷含量测定方法是在参考2015版《中国药典》中熟地黄【含量测定】项下方法的基础上,结合实际情况适当调整的结果,最终确定流动相组成及比例为乙腈-0.1%乙酸水溶液(18∶82)。在该条件下,目标成分与干扰成分可达到很好的分离效果[1,7-8]。

笔者对地黄蒸制过程中的相关因素进行了系统研究。结果发现,地黄经炮制后毛蕊花糖苷的含量会发生明显降低,但蒸制方式,即加压和常压蒸制对毛蕊花糖苷含量的影响没有明显差异,反倒是“回润”这一过程可导致毛蕊花糖苷含量降低；而不同的蒸制原料对毛蕊花糖苷含量的影响也具有一定差异,地黄饮片较个子在蒸制过程中毛蕊花糖苷含量随时间下降的速率更慢。此外,地黄中毛蕊花糖苷的含量虽然随着蒸制时间的延长而降低,但实际上在蒸制到8 h之后毛蕊花糖苷含量的下降速率才开始加快,而蒸制8 h与12 h的熟地黄在品相上无明显差异。因此,从保证熟地黄中毛蕊花糖苷含量的角度来看,熟地黄的炮制方法以饮片直接蒸制8 h为佳。

从理论上讲,地黄中的毛蕊花糖苷属于苯乙醇苷类,其所含有的酯键可在蒸制过程中发生可逆的酯化反应[9],即酸性条件下毛蕊花糖苷可水解发生酯键断裂,生成咖啡酸和羟基络醇[10],使毛蕊花糖苷的含量降低,这也是地黄在“回润”的过程中毛蕊花糖苷含量会发生下降的原因。同时,这些中间产物又可在加热的酸性条件下通过酯化反应生成毛蕊花糖苷[11,12],从而弥补毛蕊花糖苷的损失,这也是为何地黄经蒸制后随时间变化,毛蕊花糖苷的含量没有急剧降低的原因。此外,地黄饮片较地黄个子在蒸制过程中含量降低速率低,怀疑也与地黄饮片与环境接触面积大、可逆反应所需条件更充足有关。

综上所述,为得到毛蕊花糖苷含量更高的熟地黄饮片炮制工艺,本文从理论和实践上对地黄蒸制过程中的相关因素进行了系统研究,并结合传统工艺进行综合考量,认为熟地黄的炮制方法以地黄饮片直接蒸制8 h更合理。