柔毛淫羊藿中淫羊藿苷含量测定及最佳采收期研究

谭苑芬，梁文能

（广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405）

淫羊藿为小檗科植物淫羊藿属植物EpimediumL.，主要来源于淫羊藿Epimedium brevicornuMaxim，箭叶淫羊藿EpimediumsagittatumMaxim，柔毛淫羊藿Epimedium pubescensMaxim，巫山淫羊藿Epimedium wushanenseT.Sying和朝鲜淫羊藿Epimedium koreanumMaxim的干燥叶。淫羊藿味甘、性温，入肝、肾经，有补肝肾、强筋骨和祛风湿作用，临床主要用于肾虚阳痿、尿频、筋骨痿软及风寒湿痹等证[1-3]。目前对淫羊藿的研究主要在于其化学成分的测定[4-5]和淫羊藿苷的含量测定[6-9]。淫羊藿苷为评价淫羊藿质量的指标性成分，具有提高人体免疫力、改善心血管功能、增加性腺功能、抗肿瘤、抗炎、补肝肾等功效[10-11]。本研究中参考文献 [12-14] 建立了测定不同采收期柔毛淫羊藿中淫羊藿苷含量的高效液相色谱法，并分析了淫羊藿药材的最佳采收时间。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Shimadzu LC-20A型高效液相色谱仪（日本岛津公司），含四元洗脱泵、全自动进样器、二极管阵列检测器（DAD）；BSA124S型电子分析天平（德国赛多利斯公司）；KG-300DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

淫羊藿对照品（批号为 110737-201416，纯度为94.2%），购自中国食品药品检定研究院。柔毛淫羊藿药材于2016年8月至2017年7月采收于甘肃省陇南市，经黄昌杰副主任药师鉴定为小檗科植物淫羊藿属Epimedium柔毛淫羊藿Epimedium pubescensMaxim，采集植物均为生长2～3叶的植株，同一颗植物每月采收1次，连续采集12个月，以此编号为1～12，具体采收时间见表1，采收后均置阴凉通风房间阴干，除去杂质，备用。乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

表1 不同采收期的淫羊藿药材质量

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈 -0.1% 磷酸溶液（25 ∶75，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：270 nm；进样量：10 μL。

2.2 溶液制备

称取淫羊藿苷对照品11.68mg，精密称定，置100mL容量瓶中，加乙醇溶解并定容，作为对照品贮备溶液，精密吸取5 mL置10 mL容量瓶中，加乙醇定容，得每1 mL含淫羊藿苷58.40 μg的对照品溶液。取采摘阴干的药材样品（序号为10），粉碎，过4号筛，称取粉末0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，密塞，称定质量，回流提取1 h，放冷，再称定质量，用稀乙醇补足减失的质量，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

2.3 方法学考察

系统适用性试验：取2.2项下供试品溶液和对照品溶液，按拟订色谱条件进样，记录色谱图，见图1。理论板数按淫羊藿苷峰计不低于5 000，分离度大于1.5，分离良好。

图1 柔毛淫羊藿高效液相色谱图

线性关系考察：精密吸取2.2项下对照品溶液1，2，5，10，20 μL，按拟订色谱条件测定峰面积，以进样量（X，ng）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y=2.950X+4.127，r=0.999 9（n=5）。结果表明，淫羊藿苷进样量在58.40～1 168.00 ng范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取2.2项下对照品溶液，按拟订色谱条件分别进样 1，5，20 μL，每个体积连续进样 6 次，记录峰面积。结果的RSD分别为2.37%，1.06%，0.38%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：室温下取2.2项下供试品溶液，按拟订色谱条件，分别在放置 0，1，2，4，8，12，24 h 时进样测定，进样量为10 μL，连续考察24 h，记录淫羊藿苷色谱峰面积。结果的RSD为2.32%（n=7），表明室温下供试品溶液在24 h内稳定。

重复性试验：取药材样品（序号为10），依法同时制备6份供试品溶液，按拟订色谱条件进样，测定淫羊藿苷含量。结果的RSD为0.98%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：称取已知含量的药材样品粉末0.25 g，精密称定，共6份，另精密量取对照品溶液10.12 mg，置 10 mL容量瓶中（每 1 mL含淫羊藿苷1.012 mg），分别精密量取1 mL，加入上述6份样品中，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，计算回收率。结果见表2。

表2 淫羊藿苷加样回收试验结果（n=6）

2.4 样品含量测定

取前述不同时期采摘的药材样品，依法制备供试品溶液，各平行制备2份，按拟订色谱条件进样测定，外标法计算淫羊藿苷含量，测定结果按干燥品计算。结果见表3和图2。

表3 不同采收期淫羊藿苷含量测定结果（%）

图2 不同采收期淫羊藿苷含量折线图

3 讨论

3.1 供试品溶液制备

试验前先用正交试验考察了不同溶剂（甲醇、乙醇、稀乙醇）和不同提取方式（超声、回流、索氏提取）对柔毛淫羊藿中淫羊藿苷含量的影响，结果发现，采用稀乙醇作为提取溶剂时，回流提取和索氏提取的淫羊藿苷含量均高于超声提取，索氏提取所用溶剂较少，提取效率高，但回流提取简单易操作，且和药典的提取溶剂一致。因此，本试验中选择稀乙醇为提取溶剂回流提取1 h作为供试品溶液的制备方法。

3.2 色谱条件选择

本试验中参考2015年版《中国药典（一部）》淫羊藿药材[15]项下含量测定条件，首先对流动相的组成和检测波长进行了考察，采用DAD对淫羊藿苷对照品溶液在200～400 nm内进行全波长扫描，结果发现，在270 nm波长处有最大吸收，因此本试验中选择检测波长为270 nm。同时比较了以乙腈 -水，甲醇-水，乙腈-0.1%磷酸，甲醇-0.1%溶液醋酸分别作为流动相的效果，结果发现，当采用药典中所载乙腈-水作为流动相时，供试品溶液中淫羊藿苷的色谱峰有拖尾现象，且分离度不好，有干扰；而采用乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相时，供试品溶液中淫羊藿苷的色谱峰峰形良好，拖尾减少，对称因子为1.01，理论板数高，无其他色谱峰干扰。因此，试验确定乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相，检测波长为270 nm。

3.3 最佳采收期分析

本研究结果显示，不同时期采收的柔毛淫羊藿药材中淫羊藿苷含量差异较大，7月采收的含量最高（可达0.723 9%），8月后含量开始降低，2月含量最低（0.223 5%）。根据《中国药典》标准，淫羊藿苷是评价和控制淫羊藿药材的重要指标，而不同时期采收的淫羊藿药材对其临床使用有一定影响。由本试验结果可知，柔毛淫羊藿的最佳采收期为每年7月，此时采收的药材能最大限度地保证药效，这可为开发淫羊藿药材的利用价值提供参考。