姜黄素对非通气侧肺损伤模型大鼠单肺通气的改善作用研究

王小娟，王信磊

（1.中国人民解放军第九四医院，江西 南昌 330002； 2.南昌大学第一附属医院，江西 南昌 330002）

单肺通气是胸部手术后急性肺损伤的主要原因。研究表明，机械通气、肺毛细血管张力衰竭、氧化应激或缺血再灌注损伤均可引起单肺通气肺损伤[1-3]。磷脂酰肌醇 3-激酶（PI3K）-蛋白激酶 B（PKB，Akt）-低氧诱导因子-1α（HIF-1α）信号传导通路能调控肺泡存活、阻止肺泡细胞凋亡、促进损伤肺泡细胞再生[4]。PI3Ks不仅是Akt的激活物，还可能是Akt在胞浆中的锚定器，当信号通路无活性时，它就将Akt固定在胞浆中，一旦有信号刺激Akt磷酸化及二聚体化，它就激活Akt，并将其转移到胞核或其他活化位点，再进一步磷酸化下游底物，进而导致Akt受体通道开放时间延长，HIF-1α活性增强，诱导一系列氧化损伤及免疫反应[5-6]。姜黄素是从一些姜科、天南星科植物的根茎中提取的化学成分，有调血脂、抗肿瘤、抗炎、利胆、抗氧化等作用[7]。本研究中拟基于PI3K-Akt-HIF-1α信号通路探讨姜黄素对非通气侧肺损伤模型大鼠单肺通气的改善作用，为相关疾病的干预治疗提供依据。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物、试药与仪器

动物：清洁级SD大鼠100只，雌雄兼半，12周龄，体质量（108.65±12.09）g，由山东大学医学院动物实验中心提供，动物生产许可证号：SCXK（鲁）20001003。动物自由摄取饲料及饮水，自动控制昼夜循环（12/12 h），室温（22±1）℃。每周称体质量1次，每周调换笼位1次，符合《中华人民共和国实验动物管理条例》要求。

试药：姜黄素（自行提取，每1 g提取物浓缩液相当于生药 10.39 g）；PI3K，Akt，HIF-1α 及血管内皮生长因子（VEGF）、白细胞介素 6（IL-6）、肿瘤坏死因子 -α（TNF- α）、酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒（批号分别为 KIT130974-6，KIT132087-3，KIT109759-4，KIT130854-4，KIT132058-7，KIT109793-4）均购自上海广锐生物科技有限公司；PI3K，Akt，HIF-1α逆转录试剂盒及实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）试剂盒均购自宝生物工程大连有限公司；BisulFlashTMDNA甲基化修饰试剂盒（宝生物工程<大连>有限公司）。

仪器：实时荧光定量PCR仪（美国BIO-RAD公司）；CX21型光子显微镜（日本Olympus公司）。

1.2 分组、给药与建模

将100只SD大鼠随机分为5组，即正常对照（等体积0.9%氯化钠溶液）组、模型（等体积0.9%氯化钠溶液）组和姜黄素高、中、低剂量（20，10，5mg/kg）组，各20只。根据成人剂量公式换算，大鼠用药量为成人的20.13倍，以10.0 mL/kg剂量灌胃，将药液质量浓度制备成10.0 g/mL。模型组与姜黄素高、中、低剂量组大鼠腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉，开始剂量为50 mg/kg，然后减少至15 mg/kg（每间隔1 h给药1次）。行气管切开术后，用16号导管插管，并在室内空气中以每分钟100循环的呼吸速率维持2.5 mL潮气量的机械通气。在机械通气期间施加1.5 cmH2O（1 cmH2O=0.098 kPa）的呼气末正压。在第五肋间进行右侧胸廓切开术后，将气管导管插入左主支气管深处，并将潮气量减少至2.0 mL。在一段特定的单肺通气后，气管导管从左主支气管撤回到气管，并使用10 mL注射器通过气管导管将8 mL空气注入双肺，使右肺重新扩张。随后，将潮气量增加至2.5 mL，并进行双肺通气。术后给予20万U青霉素肌肉注射，连续3 d。建模成功后，各组大鼠灌胃相应药物，每天1次，连续7 d。

1.3 观察指标测定

湿肺质量/体质量的测定及肺损伤评分：灌胃给药结束后，颈椎脱臼处死大鼠，取右肺组织，测定并计算湿肺质量/体质量；随后取右侧部分肺组织进行常规染色切片，镜下阅片，就肺间质水肿、肺泡水肿、中性粒细胞浸润和肺泡内充血4项进行评分，无改变或改变非常轻微为0分，轻度改变为1分，中度改变为2分，重度改变为3分，极重度改变为4分，累计4项的总分即为肺损伤评分。

PI3K，Akt，HIF-1α mRNA 表达水平测定：采用PCR法。以Trizol法提取总RNA。反转录制备cDNA。使用内源性U6小核RNA（U6）进行标准化（U6上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；下游 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′）。通过 2-ΔΔCT法计算 PI3K、Akt、HIF-1α mRNA相对表达水平。PCR引物序列如下，PI3K 上游：5′-AGTCTATACAAGGGCAAGCTCTC-3′，下 游 ：5′-CCCAATACGACCAAATCCGTT-3′；Akt上游：5′-ATTTCACCAATCTTGTCTCCATCA-3′，下游：5′-CTCCTCCTGTTCGACAGTCAGC-3′；HIF-1α 上游：5′-ATTCTACCAATCTTGTATCTACG-3′，下 游 ：5′-ATTCTGCTGTTCGACAGATTCG-3′。反应体系，正向引物 10 μL、反向引物 10 μL、RNA 模版 0.6 μL、超级酶混合物 0.2 μL、2 × 反应缓冲液 5 μL、去 RNA 水 3.4 μL。PCR条件，95℃持续10 min，循环40次，持续15 s，温度60℃。

PI3K，Akt，HIF-1α，VEGF，IL-6，TNF-α 蛋白表达水平测定：采用ELISA法。称取大鼠右侧肺组织，制成匀浆，收集上清液，按试剂盒说明书测定。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 湿肺质量/体质量比值、肺损伤评分

结果见表1。与正常对照组比较，模型组大鼠湿肺质量/体质量、肺损伤评分显著升高（P<0.05）；与模型组比较，姜黄素高、中、低剂量组大鼠湿肺质量/体质量、肺损伤评分均明显降低（P<0.05），且随着姜黄素给药剂量的增加，湿肺质量/体质量、肺损伤评分逐渐降低，剂量-效应关系明显。

表1 各组大鼠湿肺质量/体质量、肺损伤评分比较（±s，n=20）

表1 各组大鼠湿肺质量/体质量、肺损伤评分比较（±s，n=20）

注：与正常对照组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05。下表同。

组别正常对照组模型组姜黄素低剂量组姜黄素中剂量组姜黄素高剂量组剂量（mg/kg）5 10 20湿肺质量/体质量4.92±0.32 10.04±0.49#8.32±0.36*6.24±0.41*5.00±0.52*肺损伤评分（分）2.20±0.21 8.75±0.37#5.35±0.31*4.91±0.26*2.31±0.50*

2.2 右侧肺组织HE染色

采用苏木素-伊红（HE）染色，结果见图1。正常对照组大鼠未见明显肺泡破坏，无中性粒细胞浸润，无胶原蛋白沉淀；模型组大鼠肺泡严重破坏，肺泡壁明显增厚，较多胶原蛋白沉淀于肺间质，中性粒细胞浸润明显；姜黄素低、中剂量组大鼠肺泡破坏程度较模型组轻，有较多中性粒细胞浸润；姜黄素高剂量组大鼠肺泡结构基本正常，有少量中性粒细胞浸润，几乎无胶原蛋白沉淀。

图1 各组大鼠右侧肺组织染色比较（HE，×400）

2.3 肺组织中PI3K，Akt，HIF-1α mRNA表达水平

结果见表2。与正常对照组比较，模型组大鼠肺组织中PI3K及AktmRNA表达水平显著降低，HIF-1αmRNA表达水平显著升高（P<0.05）；与模型组比较，姜黄素高、中、低剂量组大鼠肺组织中PI3K及Akt mRNA表达水平显著升高，HIF-1α mRNA表达水平显著降低（P<0.05），且随着姜黄素给药剂量的增加，PI3K及Akt mRNA表达水平逐渐升高，HIF-1α mRNA表达水平逐渐降低，剂量-效应关系明显。

表2 各组大鼠肺组织中PI3K，Akt，HIF-1α mRNA表达水平比较（±s，n=20）

表2 各组大鼠肺组织中PI3K，Akt，HIF-1α mRNA表达水平比较（±s，n=20）

组别正常对照组模型组姜黄素低剂量组姜黄素中剂量组姜黄素高剂量组剂量（mg/kg）5 10 20 PI3K 1.76±0.17 0.98±0.12#1.09±0.17*1.12±0.16*1.73±0.20*Akt 1.94±0.11 0.56±0.13#0.91±0.18*1.49±0.20*1.90±0.11*HIF-1α 1.13±0.21 2.18±0.19#1.87±0.18*1.52±0.09*1.16±0.19*

2.4 肺组织中 PI3K，Akt，HIF-1α，VEGF，IL-6，TNF-α蛋白表达水平

结果见表3。与正常对照组比较，模型组大鼠肺组织中PI3K和Akt蛋白表达水平显著降低，HIF-1α，VEGF，IL-6，TNF-α蛋白表达水平均显著升高（P<0.05）；与模型组比较，姜黄素高、中、低剂量组大鼠肺组织中PI3K和Akt蛋白表达水平显著升高，HIF-1α，VEGF，IL-6，TNF-α蛋白表达水平均显著降低（P<0.05），且随着姜黄素给药剂量的增加，PI3K和Akt蛋白表达水平逐渐升高，HIF-1α，VEGF，IL-6，TNF-α 蛋白表达水平逐渐降低，剂量-效应关系明显。

表3 各组大鼠肺组织中PI3K，Akt，HIF-1α，VEGF，IL-6，TNF-α 蛋白表达水平比较（±s，ng/g，n=20）

表3 各组大鼠肺组织中PI3K，Akt，HIF-1α，VEGF，IL-6，TNF-α 蛋白表达水平比较（±s，ng/g，n=20）

组别正常对照组模型组姜黄素低剂量组姜黄素中剂量组姜黄素高剂量组剂量（mg/kg）5 10 20 PI3K 183.67±15.63 71.14±16.78#103.73±13.65*123.17±99.69*181.58±13.74*Akt 145.77±6.46 67.86±6.98#89.45±6.98*120.15±10.69*139.63±12.73*HIF-1α 47.13±15.95 187.66±9.47#134.14±12.74*63.23±10.73*49.45±18.76*VEGF 78.98±16.32 326.21±19.69#201.36±15.32*136.32±18.32*81.32±24.36*IL-6 123.65±23.21 413.65±13.69#302.67±19.32*203.36±17.32*129.68±36.69*TNF-α 99.36±18.63 589.36±18.34#432.39±15.39*319.25±19.99*103.26±26.39*

3 讨论

单肺通气是胸外科手术中的常规操作，其优化了手术的进入区域，在手术过程中隔离保护肺部，加快了手术过程。但在单肺通气期间，非通气肺塌陷仍需灌注，导致毛细血管局部栓塞，引发氧化损伤，缺血或不通气导致的氧缺乏进一步加重肺泡细胞缺氧损伤[8-9]。在单肺通气引发的非通气侧肺损伤中，若使用抗自由基药物，则其非通气侧肺损伤程度明显降低[10-11]。本研究结果显示，姜黄素能明显降低模型大鼠单肺通气引发非通气侧肺损伤程度。

肺组织缺血引发的缺氧与海马区域中抑制性氨基酸类神经递质、兴奋性氨基酸类神经递质比例失调密切相关，认知功能障碍发生过程中，神经元去极化，钠离子等阳离子大量内流，导致海马区域中兴奋性氨基酸类神经递质谷氨酸（Glu）大量释放，同时 γ-氨基丁酸（GABA）比例升高，进一步导致钙离子内流，形成细胞内钙超载，钙离子作为第二信使，激活PI3K/Akt信号途径[12-14]。HIF-1α是PI3K/Akt的下游调控因子，为碱性螺旋PAS结构域蛋白的异二聚体，其水平在机体监测到缺氧后立即升高，当血液中氧含量恢复正常水平后，HIF-1α通过蛋白依赖性蛋白酶体途径连续降解，因此常氧条件下HIF-1α维持在低水平[15-16]。本研究结果显示，姜黄素可通过PI3K-Akt信号传导通路抑制HIF-1α mRNA及蛋白表达水平。

低氧刺激导致HIF-1α mRNA及蛋白水平快速增加，这是氧化还原敏感稳定的结果。在HIF-1异二聚化为HIF-1α后，进入细胞核并在靶基因的缺氧反应元件（HRE）处与 DNA 结合，促进 VEGF，IL-6，TNF-α的表达，进而引发一系列氧化损伤及免疫反应[17-18]。本研究结果显示，姜黄素能明显降低单肺通气引发非通气侧肺损伤程度，其机制与姜黄素降低VEGF，IL-6，TNF-α蛋白表达水平有关。

综上所述，姜黄素能明显改善非通气侧肺损伤模型大鼠单肺通气情况，其机制与姜黄素通过PI3K-Akt信号传导通路抑制HIF-1α mRNA及蛋白表达水平，进而抑制VEGF，IL-6，TNF-α蛋白表达有关。