雌激素对小肠葡萄糖吸收的调节及机制研究

陈长梅，杜 倩，谢 睿，徐靖宇，陈远寿

(1.遵义医科大学 生理学教研室，贵州 遵义 563099；2.遵义医科大学附属医院 消化内科,贵州 遵义 563099)

肥胖是21世纪最严重的公共卫生流行病之一，目前已经成为全球性问题。研究发现：绝经后女性与绝经前相比，前者患肥胖的可能性增加三倍[1]。据美国胆固醇教育计划成人治疗组第三次调查报告显示，60岁以前女性肥胖的发病率普遍低于男性，在60～69岁时发病率迅速上升，到70岁以上女性肥胖的发病率已经明显超过同龄男性[2]。2009年关于北京市成年女性绝经前后肥胖发病情况分析结果显示，女性在50岁之前发病率显著低于男性，从50岁开始肥胖发病率(显著)升高迅速，开始超过男性[3]。以上研究提示雌激素减少与女性肥胖的发生发展密切相关。

钙离子主要通过与钙敏感受体(Calcium-sensing receptor，CaSR)结合后产生作用。CaSR是一种G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs)，是调节机体内钙离子平衡的主要受体，其介导的细胞内钙信号参与了多种途径影响肠道运动。例如：调节胰高血糖素样肽1(Glucagon-likepeptide1,GLP-1)、酪酪肽(Peptide tyrosine tyrosine，PYY)以及抑胃肽等脑肠肽的释放，以维持机体能量及葡萄糖代谢平衡[4-5]。但是目前有关雌激素-钙敏感受体与葡萄糖吸收之间的相互关系鲜有报道。因此，在本项目中，我们研究在雌激素分泌缺失情况下，CaSR在小鼠十二指肠的表达，及其在十二指肠葡萄糖吸收中的作用，为研究雌激素对肥胖的影响提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验分组 4周龄SPF级C57雌鼠(重庆陆军军医大学附属大坪医院动物中心提供)，选择性成熟期(6周龄)C57雌鼠36只在全麻下进行假手术和去卵巢，把18只去卵巢雌性C57小鼠作为去卵巢组，18只假手术雌性C57小鼠作为假手术组。卵巢切除手术步骤：术前12 h 禁食不禁饮，按80mg/kg体重的剂量给予小鼠腹腔注射浓度为0.5%戊巴比妥钠。小鼠麻醉后行背部切口，分离组织找到呈粉红色桑葚样卵巢，切除卵巢止血后把输卵管还纳入腹腔，缝合切口并涂抹金霉素眼膏，术后保暖以促进小鼠复苏，每天涂药以防止切口感染，待小鼠伤口完全愈合。手术2周后进行实验。

1.2 主要实验材料及试剂 CaSR (ab19347)和β-actin单克隆抗体购自Abcam公司，牛血清白蛋白(BSA)购自北京博奥拓达科技有限公司、封闭蛋白干粉购自武汉博士德生物技术有限公司、鼠二抗购自艾比玛特生物医药(上海)有限公司和兔二抗购自艾比玛特生物医药(上海)有限公司、免疫组化试剂盒购于北京博奥森生物公司，EVC4000、Ussing Chamber(美国WPI公司)，雌二醇检测试剂盒购自北京北方生物技术研究所，氯化钠、氯化镁、氯化钙、葡萄糖酸钠、葡萄糖酸钾、碳酸氢钠、K2HPO4及 KH2PO4均购自Sangon Biotech公司，Glycine与Tris购自Biofroxx公司，SDS购自Solarbio公司。

1.3 Ussing chamber实验

1.3.1 工作液配制 粘膜侧工作液：用量筒分别量取配置好的储备液2.3 mol/L NaCl溶液、0.5 mol/L 葡萄糖酸钠溶液、0.104 mol/L葡萄糖酸钾溶液、24 mmol/L MgCl2溶液、24 mmol/L CaCl2各25 mL混匀，称取0.911g甘露醇加入上述混合液中(终浓度为10 mmol/L)，最后用超纯水定容至500 mL，用100% O2充气1 h至溶液澄清后4℃存储备用。

浆膜侧工作液：用量筒分别量取2.3 mol/L NaCl溶液、0.5 mol/L NaHCO3溶液、44 mmol/L K2HPO4/16 mmol/L KH2PO4溶液、24 mmol/L MgCl2溶液、24 mmol/L CaCl2溶液各25 mL混匀，称取0.9g D-葡萄糖(分子量180.16)加入上述混合液中(终浓度10 mmol/L)，加超纯水定容至500 mL，用混合气体(95%O2+5%CO2)充气1 h至溶液澄清4 ℃存储备用。

1.3.2 实验装置准备 在U型装置内加入电解质缓冲液，U型管外套中循环流动着恒温37 ℃的水浴，以确保肠组织能够处于合适的温度环境中，并对电压电极和液体阻抗进行补偿，约20 min左右。预调完成后拆开小室，用三蒸水清除U型管中的电解液。

1.3.3 标本制备与检测

1.3.3.1 取手术后2周的C57雌鼠，禁食1 h以上，采用断颈法将小鼠处死，取出小鼠远端十二指肠(约2 cm)和上段空肠(约2 cm)，立即放入含有1μM消炎痛的4 ℃等渗甘露醇溶液中，将肠段放置在表面放置了封口膜的平整的石蜡块上，并用上述等渗甘露醇溶液将肠管淹没，沿着肠系膜将肠管切开，剥离掉浆膜及肌层组织，将粘膜及粘膜下层组织固定在chamber上(有效渗透面积为0.16 cm2)，然后组装上chamber，粘膜侧(顶端侧)加入10 mL粘膜侧工作液,并给予连续的、均匀的100%氧气灌注；浆膜侧(基底侧)加入10 mL浆膜侧工作液，并给予连续的、均匀的95%氧气+5%二氧化碳混合气体灌注，装上组织后每隔5 min记录一次短路电流(short-circuit current，Isc)，稳定15 min后，分别在粘膜侧、浆膜侧或者浆膜侧和粘膜侧予以不同的钙通道阻断剂预处理，继续观察15 min，然后在粘膜侧加入20 mM葡萄糖溶液，继续观察30 min并记录Isc，然后对短路电流差值(ΔIsc)进行比较，ΔIsc是装上组织后观察30 min加试剂处理后的峰值减去基值，基值是装上组织后观察30 min时的Isc值，ΔIsc值越高，葡萄糖吸收越多；反之亦然。

1.3.3.2 取6周龄正常C57雌鼠，按上述方法制备十二指肠和上段空肠粘膜及粘膜下层组织渗透膜进行Ussing chamber实验，以chamber工作液不加入EGTA及NPS-2143作为正常组，chamber工作液加入EGTA和/或NPS-2143作为实验组，装上组织渗透膜后每隔5 min记录1次短路电流(short-circuit current,Isc)，稳定15 min后，分别在粘膜侧、浆膜侧或者浆膜侧和粘膜侧予以Ca2+螯合剂或CaSR特异性抑制剂预处理，继续观察15 min，然后在粘膜侧加入20 mM葡萄糖溶液，继续观察30 min并记录Isc，然后对短路电流差值(△Isc)进行比较。

1.4 血清中雌二醇检测方法 经腔静脉抽血，运用放射免疫法(Radioimmunoassay，RIA)测定雌二醇水平。测定原理：采用均相竞争原理，即标准或待测血品中的E2和一定量的125I-E2共同与限量的E2抗体在适宜条件下进行竞争性结合反应，一部分与抗体结合形成抗原-抗体复合物，而另一部分，呈游离状态125I-E2与抗体结合的比例取决于标准或待测样品中非标记E2的含量，非标记E2的含量越高，125I-E2与抗体结合的比例越小；非标记E2的含量越少，125I-E2与抗体结合的比例越大。用免疫分离试剂(PR)将结合部分(B)与游离部分(F)分离后，测定结合部分的放射性活度，并计算相应结合率B/B6。用已知标准E2含量与对应结合率作图，即得标准抑制曲线，从标准曲线上查知对应结合率的样品中E2的含量。标准范围：5～4 000 pg/mL。

1.5 蛋白印迹实验(Western-blot)检测CaSR的蛋白水平 取假手术组及去卵巢组小鼠小肠组织，依次加入100 μL裂解液(PMSF和RIPA按照1∶100体积比混合)进行细胞裂解，4 ℃，12 000×g离心10 min，吸取蛋白上清溶液，保存于-80 ℃。用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。在80 V恒压条件下电泳，肉眼观察溴酚蓝到达距离玻璃板底时停止电泳。转膜，封闭：5%牛血清白蛋白，室温反应2 h。一抗结合：加入一抗(CaSR按照1∶2 000稀释)，在4 ℃反应过夜。二抗结合：放在1∶2 000倍稀释的二抗中，室温孵育2 h。显色，曝光后，用ImageJ对蛋白进行定量分析，以β-actin为内参。

2 结果

2.1 检测两组小鼠的血清雌二醇水平 小鼠血清中雌二醇水平测定结果显示，假手术组小鼠血清雌二醇水平为(175.74±145.56 pg/mL，n=10)，去卵巢组小鼠血清雌二醇水平为(13.12±5.14 pg/mL，n=10)，与假手术组小鼠相比，去卵巢组小鼠血清雌二醇水平明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.2 Ussing chamber检测葡萄糖在小肠吸收的变化 实验结果显示：去卵巢组葡萄糖吸收升高明显引起ΔIsc的变化(n=5，P<0.05，vs假手术组)(见图1)。

A：Isc检测结果；B：葡萄糖刺激前后ΔIsc的比较(n=5，与假手术组相比，*：P<0.05)。图1 雌激素不同水平对小鼠小肠葡萄糖吸收的ΔIsc变化

2.3 Western-Blot检测两组小鼠小肠CaSR蛋白的表达 Western-Blot结果显示：假手术组及去卵巢组小鼠小肠上皮组织均有CaSR蛋白表达，与假手术组相比去卵巢组小鼠小肠上皮组织CaSR蛋白表达减少，且差异具有统计学意义(P<0.05)。结果如图2所示，提示雌激素缺乏会导致十二指肠CaSR表达的降低。

A：Western-Blot检测结果；B：CaSR蛋白相对表达量分析假手术组与去卵巢组小鼠十二指肠CaSR的表达(n=4，与假手术组相比，*：P<0.05)。图2 Western-Blot检测各组小鼠小肠CaSR的表达

2.4 Ca2+螯合剂、CaSR特异性抑制剂对葡萄糖吸收的影响 分别在粘膜侧、浆膜侧、粘膜与浆膜双侧均加入EGTA(0.1 mM)及NPS-2143(30 mM)。实验结果显示：(1)浆膜侧加EGTA(n=6，P<0.05vs正常组)和双侧加EGTA(n=6，P<0.05vs正常组)均明显抑制葡萄糖吸收引起的ΔIsc变化，而粘膜侧加EGTA不改变葡萄糖吸收引起的ΔIsc(n=6，P>0.05vs正常组)(见图3A、3C)；(2)浆膜侧加NPS-2143(n=6，P<0.05vs正常组)和双侧加NPS-2143(n=6，P<0.05vs正常组)均抑制葡萄糖吸收引起的ΔIsc变化，而粘膜侧加NPS-2143不改变葡萄糖吸收引起的ΔIsc变化(n=6，P>0.05vs正常组)(见图3B、3D)。

A：加入EGTA后的Isc变化；B：加入NPS后的Isc变化；C：加入EGTA后的ΔIsc变化；D：加入NPS后的ΔIsc变化(n=6，与正常组相比，*：P<0.05)。图3 加入EGTA和NPS-2143后葡萄糖吸收的ΔIsc变化

3 讨论

流行病学调查研究显示，随着年龄的增长，肥胖发生率迅速上升，与绝经前女性相比，绝经后女性肥胖发生率增加了3倍[2-3]，提示雌激素分泌减少可能是导致女性绝经后肥胖比率增高的主要原因。

我们团队前期的研究发现雌激素能够参与调节十二指肠粘膜上皮细胞的氯离子、碳酸氢盐及钙离子的分泌[6-7]。在早期的研究中，Ghijsen等[8]在切除了卵巢的小鼠模型中发现手术组小鼠血清雌激素水平明显下降，进而导致小肠Ca2+吸收减少。我们的研究证实了Ghijsen等的研究成果，发现去卵巢组葡萄糖吸收引起的ΔIsc变化明显高于假手术组，提示雌激素可能参与小肠葡萄糖吸收的转运过程，这个转运过程与雌激素分泌高低密切相关。最近一项研究[9]发现，去卵巢会引起大鼠甲状旁腺中CaSR的表达量显著降低，而预防性注射β-雌二醇会使甲状旁腺中CaSR的表达量显著升高，提示雌激素可以调节甲状旁腺中CaSR的表达。本研究证实，在卵巢切除后的小鼠中，小肠上皮组织中CaSR的表达相对于在正常小肠上皮组织中的表达明显降低，这一结果提示雌激素分泌缺乏能影响小鼠小肠上皮CaSR的表达。

众所周知，CaSR最早是1993年从牛甲状旁腺中克隆和分离出来的，是G蛋白偶联家族中的成员之一，主要包括胞外区、跨膜区及胞内区三个独立的区域[10]。CaSR激活后，会促进细胞内钙活化，从而激活胞内下游信号通路，发生相关生物学行为[11]。早期的研究发现，CaSR位于甲状旁腺细胞表面，能够感应细胞外Ca2+浓度的细微变化，从而快速调控甲状旁腺激素(Parathyroid hormone，PTH)的分泌，同时，雌激素也能通过相对应的细胞受体系统影响PTH的表达及分泌[12]。1993年，Mckane等的研究发现，雌激素缺乏会导致肠钙吸收降低，PTH分泌增多，进而影响CaSR的表达[13]。有文献报道，钙离子参与小肠上皮细胞的生物学行为，其主要来源是浆膜侧钙流入[14]，而我们的研究发现，CaSR在小肠粘膜侧及浆膜侧均有表达，但主要表达在浆膜侧[15]。目前，有关CaSR与葡萄糖吸收之间的研究还鲜有报道。为了证实CaSR在小肠上皮组织葡萄糖中的调节作用，我们运用Ca2+螯合剂EGTA及CaSR阻断剂NPS-2143进行Ussing chamber实验，结果发现：加入EGTA及NPS-2143后，葡萄糖介导的ΔIsc显著降低，提示钙敏感受体及其介导的钙信号可能参与了葡萄糖的吸收。但是目前还没有证据直接证实钙敏感受体及其钙信号直接参与葡萄糖的吸收，那么钙敏感受体及其介导的钙信号是如何参与调控葡萄糖吸收的呢？有文献报道，葡萄糖的吸收主要依靠顶端细胞膜上Na+/葡萄糖同向转运蛋白(Sodium-dependent glucose transporters 1，SGLT1)及基底细胞膜上的葡萄糖转运蛋白(Glucose transporter 2，GLUT2)介导[16]。随着肠腔葡萄糖浓度升高，葡萄糖与钠离子经由细胞膜上的SGLT1共同转运至小肠粘膜上皮细胞内导致细胞膜去极化，使Cav1.3通道开放，促使Ca2+内流，细胞内Ca2+浓度的增加激活了细胞内肌球蛋白轻链激酶(Myosin light chain kinase ，MLCK)，从而使终末网周围链接肌球蛋白环上肌球蛋白轻链Ser19磷酸化，导致细胞周围连接肌动蛋白环收缩及细胞骨架重排，导致GLUT2从终末网顺利易位到小肠粘膜上皮细胞顶膜而参与葡萄糖吸收[17-18]。除此以外，激活钙调蛋白(Calmodulin，CaM)与钙调蛋白依赖蛋白激酶β(calcium/calmodulin-dependent protein kinase kinaseβ CaMKKβ)[19]。CaMKKβ使腺苷酸激活蛋白激酶(Adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase，AMPK)和AMPK下游的酰基辅酶A羧化酶(acyl coenzyme A carboxylase， ACC)磷酸化，从而激活AMPK[20-21]。有研究报道，激活的AMPK通过参与调节小肠粘膜上皮细胞顶膜上GLUT2 和(或)SGLT1的表达进而调节小肠道葡萄糖的吸收[22-23]。因此我们有理由认为，CaSR介导的钙信号也参与了对GLUT2 和(或)SGLT1的调节，进而影响了葡萄糖的吸收。

综上所述，我们的结果首次证实了雌激素对小肠葡萄糖吸收的影响，即雌激素分泌减少可以促进小肠对葡萄糖的吸收，并且这一过程主要是通过调节对CaSR在小肠上皮细胞上的表达及功能来实现的，这为我们进一步研究女性绝经后肥胖的发生提供了新的理论基础。