沉默信息调节蛋白1与心肌缺血/再灌注损伤的研究进展

阳徐良，梁贵友

(遵义医科大学附属医院 心血管外科,贵州 遵义 563099)

目前，体外循环(Cardio-pulmonary Bypass，CPB)技术是心脏外科心内直视手术所必需的技术手段，但是CPB术后心肌存在缺血再灌注损伤(myocardial ischemia/reperfusion injury ,MIRI)却不容忽视。MIRI是指心肌经过一段时间的缺血缺氧再恢复血供时，心肌损伤非但没有减轻或恢复，反而发生更为严重的心肌损伤。缺血预处理(IPC)、热量限制、白藜芦醇可以预防MIRI，以达到保护心肌的作用。这些心肌保护作用的机制是由一种依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的第Ⅲ类组蛋白/非组蛋白去乙酰化酶控制的，这种去乙酰化酶被称为沉默信息调节蛋白1(silence information regulator protein 1，SIRT1)[1-4]。SIRT1在心肌细胞内可使许多转录因子去乙酰化，包括叉头蛋白(FOXO)转录因子、P53、核因子NF-κB、过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1-α(PGC1-α)、过氧化物酶体增殖剂激活受体-γ(PPAR-γ)、一氧化氮合酶(eNOS)等[5]，通过增强心肌细胞抗氧化应激能力、减轻炎症反应、抑制心肌细胞凋亡与坏死、调节能量代谢、调节自噬、增强心肌舒缩功能，从而在MIRI中发挥重要作用，保护受损的心肌细胞。因此深入研究和挖掘SIRT1在MIRI中的保护机制十分必要，开发新的有效的SIRT1激动剂对于临床预防和治疗MIRI有着巨大作用。

1 MIRI的发生机制

随着大量关于MIRI的发生机制的研究，目前一般认为是以下因素参与了MIRI的发生：①氧自由基(ROS)爆发：MIRI中ROS产生的主要来源有线粒体呼吸链途径、黄嘌呤氧化酶途径和花生四烯酸代谢途径[6]，其中，线粒体被普遍认为是MIRI中ROS产生最主要的场所[7]。ROS的大量堆积使得心肌细胞膜上的脂质发生过氧化，心肌细胞的膜蛋白、酶功能以及活性进一步降低，心肌细胞的核酸和蛋白质发生交联、变形，最终心肌出现可逆性损伤。②钙超载：再灌注后，心肌细胞膜通透性增加，大量胞外Ca2+顺浓度梯度内流(心肌细胞膜钙漏)；缺血(缺氧)时心肌细胞能量代谢主要依靠糖酵解产生乳酸供能，Na+-K+ATP酶在缺血时停止转运，因此MIRI后心肌细胞内乳酸堆积，细胞内酸中毒，胞内H+浓度骤增激活H+/Na+交换，使大量的Na+内流进而激活Na+/Ca2+交换，导致Ca2+内流，细胞内Ca2+积聚。Ca2+超载对心肌的损伤主要是导致线粒体的功能障碍，Ca2+能在线粒体内形成磷酸钙盐并沉积破坏线粒体结构和功能，抑制线粒体内的氧化磷酸化，导致ATP生成减少，并引起钙依赖性的线粒体渗透性转换孔(mPTP)持久性改变[8]。同时，钙超载引起的线粒体损伤加剧ROS对心肌细胞的损伤。③线粒体损伤：线粒体已经成为缺血再灌注期间心肌损伤的关键靶点和组织损伤的根源。电子传递链(ETC)的损伤主要发生在心肌缺血期[7]。心肌I/R产生的ROS爆发、Ca2+超载导致早期线粒体驱动损伤，引起线粒体的异常渗透，线粒体膜电位丧失，抑制mPTP开放导致线粒体的肿胀和破坏，能量供应不足而坏死[9]。④炎症：MIRI后中性粒细胞的粘附、激活，可释放许多促炎因子，如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-8(IL-8)以及弹性蛋白酶、黏附因子、胶原酶等几十种蛋白水解酶与血管内皮细胞黏附，损伤心肌血管内皮细胞，导致无复流现象并介导该区域心肌细胞出现自噬、凋亡、坏死等[10]。⑤能量代谢异常：心肌细胞离子转运、心肌收缩与舒张等过程皆需要消耗能量，依赖ATP的充足供应。而在心肌I/R期间，心肌能量来源从线粒体氧化代谢到糖酵解代谢的改变，以及糖酵解和葡萄糖氧化的解偶联，导致心脏在I/R后出现低效率工作。同时，在心肌的I/R过程中，心肌出现胰岛素抵抗现象(insulin resistance，IR)[11]，作为调节胰岛素信号通路的经典途径磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)[12]也被证实在I/R心肌IR中发挥重要作用，因此IR可能是MIRI发生的另一重要原因。

2 SIRT1的结构与分布、活性与调节

组蛋白的乙酰化-去乙酰化修饰在基因表达调控中发挥着重要作用，随着近年来对组蛋白乙酰化修饰的深入研究，已经证明了组蛋白去乙酰化与糖尿病、缺血性心肌病、先天性心脏病、肥胖等疾病密切相关，目前已知的组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDACs)主要有四大类(见表1)，特别是其中的Ⅲ型HDACs(又称sirtuins)更是受到了广泛研究。哺乳动物的sirtuins家族蛋白分为7个亚型，SIRT1～7。Sirtuins作为细胞能量和代谢的传感器，是一类依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的第Ⅲ类组蛋白/非组蛋白去乙酰化酶。在过去的几十年间，通过使用sirtuins激动剂、NAD+前体或过表达sirtuins，均发现了小鼠的器官功能得到改善并延长了寿命，Sirtuins的抗衰老作用越来越引起人们重视，其中的SIRT1仍然是研究热点。人类SIRT1由500个氨基酸残基组成，编码基因位于染色体10q21.3(全长33660bp)，为单基因位点。SIRT1 mRNA(全长4101bp)包含8个内含子和9个外显子，5’及3’端各有一个为53bp及1793bp的非翻译区，编码747个氨基酸(翻译后蛋白质量为81.7KDa)[13]。SIRT1的催化结构域具有典型的Sirtuins折叠，正如Min发现的SIR2-Af1/NAD+复合结构一样。催化核心由277个氨基酸残基构成，由一大一小结构域组成，大小结构域之间形成一个裂隙，NAD+就结合在此并发生催化反应[14]。SIRT1在大范围的组织和器官中表达，在人和小鼠的心脏、脑、肝脏、胰脏、肌肉和脂肪组织中检测到，其中在脑组织、心脏中高水平表达[15]。

表1 HDACs分类及主要作用

分类 组成 主要作用ⅠHDAC1、2、3、8调节细胞膜表明酪氨酸激酶活性维持细胞表面环境相对平衡[16]ⅡHDAC4、5、6、7、9、10调节细胞病理性变化、抗氧化应激、抗炎症[17]ⅢSirt1～7介导ADP核糖基化,可能在调节肿瘤、心血管病的发生中起作用[18]ⅣHDAC11可能具有独特的细胞生化功能,与Ⅰ型类似[19]

从酵母到人类，细胞能量代谢的原理几乎相同，都使用高度同源的途径产生和消耗能量，并且使用通用的“能量货币”(ATP和NADH)来储存和转移能量。AMP激活蛋白激酶(AMPK)感测细胞低ATP水平；Sirtuins感测NAD+/NADH水平[20]。Sirtuins家族是保守的NAD+依赖性去乙酰化酶，作为细胞传感器来检测能量可用性和调节代谢过程，在多种细胞过程中起重要作用。对于代谢控制过程而言有两种Sirtuin至关重要，其中最重要的是位于细胞核中的SIRT1，其具有乙酰化酶活性和ADP-核酸转移酶活性，依赖SIRT1的去乙酰化反应将蛋白质底物中赖氨酸上的乙酰基转移给NAD+的ADP-核糖基部分，生成尼克酰胺(NAM)和2’-O-乙酰基ADP-核糖，NAD+/NADPH和NAD+/尼克酰胺比例是调节SIRT1活性的主要机制。在小鼠缺血再灌注模型上通过外源性的静脉给药NAD+[21]，发现心肌梗死面积减少约85%，且NAD+保护作用呈剂量依赖性。而上述NAD+保护心肌的作用正是通过激活SIRT1实现的，但关于NAD+如何激动SIRT1发挥保护作用的机制还有待进一步研究。在迄今为止的大多数研究中，白藜芦醇[22]已被用做SIRT1的有效激活剂。

3 SIRT1在MIRI中的作用机制

3.1 抗氧化应激 氧自由基(ROS)的爆发是MIRI的重要因素，提高ROS清除剂如锰超氧化物(MnSOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)能有效减轻氧化损伤。调控MnSOD、CAT、GPX表达的基因受叉形头转录因子(FoxOs)调控，FoxOs转录因子在心肌细胞中高度保守，主要位于胞质中，在应激情况下，从细胞质转移到细胞核中调控靶基因的表达。在哺乳动物中，FoxOs有四种成员：FoxO1、FoxO2、FoxO3a、和FoxO4，它们控制各种细胞过程，如细胞周期停滞、活性氧产生、DNA修复和细胞凋亡。越来越多的证据表明SIRT1去乙酰化FoxOs后上调FoxOs的转录活性，增加ROS清除剂的表达，减轻心肌细胞I/R的氧化应激损伤。小檗碱(Berberine，BBR)[23]和褪黑素受体[24]可通过激活SIRT1，上调心肌超氧化物歧化酶(SOD)水平，降低心肌超氧化物、NADPH氧化酶(Gp91PHOX)、丙二醛的表达，而这些保护作用可被SIRT1抑制剂(Stnl)抑制。与此同时，在H9C2细胞的I/R模型中，SIRT1通过去乙酰化FoxO1和FoxO3，诱导FoxOs的核易位，促进ROS清除剂的表达增加，从而达到清除ROS的作用，减轻心肌细胞的氧化损伤[25]。Mingge等[26]利用SIRT1腺病毒转染技术过表达SIRT1，调节I/R大鼠的eNOS活性来减少心肌I/R损伤。亦有报道[27]指出，SIRT1还可通过激活PGC-1α减轻氧化损伤，同时上调雷帕霉素不敏感伴侣(RICTOU)的转录，触发Akt/FOXO磷酸化级联反应，激活雷帕霉素靶蛋白复合体2(mTORC2)信号。相反，SIRT1缺乏的小鼠中表现出mTORC2信号传导受损，ROS产生增加。此外在糖尿病大鼠中进行MI/R手术时发现SIRT1的活化上调核因子E-2-相关因子 (nuclearfactor erythroid-2-related factor,Nrf)- 血红素加氧酶-1 (hemeoxygenase-1，HO-1)介导的抗氧化信号通路减轻心肌损伤[28]。以上证据表明，SIRT1在保护心肌免受氧化应激损伤的过程中作用显著，为我们提供了潜在的治疗靶点。

3.2 抑制凋亡 P53是调节细胞周期和凋亡中的关键调控因子，在心肌细胞核中SIRT1将P53蛋白第382位赖氨酸残基去乙酰化[29]，降低其与DNA顺式作用元件的结合能力来抑制其转录活性，减弱对下游信号通路的激活作用，抑制促凋亡蛋白Bax、caspase-3的表达[35]，同时上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，以此减少心肌细胞凋亡[30]。小鼠I/R模型[24]的研究结果表明，SIRT1的抗凋亡作用还能通过FoxO1的去乙酰化实现，而这些抗凋亡作用可被SIRT1的特异性抑制剂EX527或SIRT1 siRNA抑制而消除。SIRT1对FoxO1的去乙酰化作用有着双向性：一方面，FoxO1的去乙酰化诱导细胞周期基因表达，如DNA修复基因(GADD45)、p27KIP、氧化应激抵抗基因(MnSOD)；另一方面，抑制诱导凋亡基因的活性，包括BIM和Fas，这种双面影响促使心肌细胞在应激情况下存活率增高。由此可见，通过SIRT1-FoxO1信号通路减轻MIRI具有多种调节方式，而绝非仅仅是增强或者减弱FoxO1活性。

内质网在缺血、缺氧等不良刺激的影响下，可出现内质网内未折叠或错误折叠蛋白的堆积，引起内质网应激(ERS)。内质网应激相关凋亡已被证参与了MIRI的形成，并且其不同于传统的死亡受体凋亡途径和线粒体凋亡途径，它是一种新的细胞凋亡途径。在基因敲除小鼠(SIRT1-/-)[31]中发现PDI和CHOP(ER水平的标志蛋白)蛋白水平分别增加了1.6倍和1.5倍；同时，在用SIRT1抑制剂处理的H9C2心肌细胞中，出现较高的ERS和心肌细胞凋亡，通过添加SIRT1激活剂可以改善这些作用。有研究发现大蒜素[28]在糖尿病小鼠I/R模型中通过激活SIRT1，能抑制由蛋白激酶类RNA内质网激酶(PERK)/真核起始因子2α(eIF2α)/转录激活因子4(ATF4) / CHOP介导的ERS，而这种保护作用同样能被EX527抑制。有趣的是，当SIRT1被抑制或遗传缺失时，不仅eIF2α乙酰化水平大大增加，eIF2α的磷酸化水平也在ERS时增加，表明这两种翻译后修饰调节方式之间存在动态的相互作用[32]，但其相互作用的机制还未见报道。但也有人通过小剂量的衣霉素(经典ERS诱导剂)上调心肌组织的热休克蛋白(GRP78，可反映ERS水平)的表达，激活适度的ERS反而能减轻MIRI。因此，如何控制ERS的激活水平，以及选用合适的激动靶点及药物是研究难点。

3.3 减轻炎症反应 炎症与MIRI密切相关，心肌缺血再灌注过程中大量的白细胞浸润在心肌组织中，释放多种细胞因子加剧心肌损伤，但其调控机制不甚清楚，最新的研究[33]显示，NOD样受体热蛋白结构域3(NLRP3)炎性体作为人类固有免疫系统的重要组成部分，在MIRI的炎症损失机制中扮演者重要角色，它能激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(Caspase1)，导致促炎细胞因子IL-1β、IL-18加工和分泌。有研究报道[34]，白藜芦醇预处理能显著降低大鼠I/R梗死面积和心肌纤维化，下调NLRP3和Csapase1的表达和IL-1β、IL-18的活化。同时，Li等[35]认为血管内皮细胞不仅是血液与血管壁之间的屏障，而且也可以作为先天免疫细胞。他们观察到脂多糖(LPS)和ATP触发了人脐静脉血管内皮细胞NLRP3的激活，同时出现SIRT1表达降低；而SIRT1激活剂可抑制NLRP3炎性小体的活化，SIRT1敲除明显增强NLRP3的活化。最重要的是，SIRT1基因沉默消除了SIRT1激动剂对NLRP3活化和Caspase1分泌的抑制。这些表明NLRP3炎性小体的激活有可能受SIRT1调节。但是对于NLRP3的激活机制一直是众说纷纭，有文献[36]认为炎症小体由SIRT1-TLR4/NF-κB途径激活，还有文献报道ROS、Ca2+、ESR都能作为第一激活条件。最有趣的是，Jong等[37]在NLPR3基因敲除小鼠I/R模型中发现，心肌梗死面积较野生型无明显差异。并且Sandanger等[38]发现下调NLRP3的表达，心肌梗死面积反而扩大。这些结果的不同，可能与动物模型之间炎症反应程度不同以及心肌损伤的指标存在差异有关。因而尚不能排除NLRP3炎性小体在MIRI中有双面性，这种作用是否依心肌损伤程度和细胞类型的不同而不同，亟待进一步探讨。

3.4 与自噬的关系 在心肌I/R过程中除了引起心肌的凋亡和坏死外，还出现心肌细胞的自噬现象。当葡萄糖剥夺时，胞质内甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的Ser122位点被活化的AMPK磷酸化后转移入核内，与SIRT1发生直接相互作用引发自噬。为了评估SIRT1在介导自噬中的作用，用Ad-SIRT1、Ad-sh-SIRT1和Ad-FoxO1、Ad-sh-FoxO1转染心肌细胞，证实SIRT1和FoxO1协同作用是诱导自噬必需的[39]。FoxO1被抑制或敲除后[40]，许多自噬相关基因(如：Atg4b、Atg12、Pik3c3、Becnl、Mapllc3b)下调，同时通过升高SESN3/Sesns3的表达水平抑制雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的活性，抑制自噬。然而目前关于自噬对MIRI影响仍有不清楚和争议，主要是有以下两个方面：①心肌细胞I/R存在自噬的阶段性，缺血期，增强自噬可促进细胞存活；而在再灌注时，自噬进一步增强却对细胞有害？②心肌缺血诱发的自噬是依赖AMPK的，而在再灌注时却是由Beclin1调控。而另一观点则认为缺血抑制mTOR诱发自噬，再灌注期是由于自噬对mTOR具有负反馈调节，防止自噬过度引起细胞死亡。正是由于自噬调节机制的复杂性以及自噬在MIRI中作用的不确定性，未来要确定的是激活自噬在MIRI中到底是起损伤还是保护作用？深入研究缺血和再灌注期两个阶段的靶点及药物选择，这样才能更好的发挥心肌内源性的保护作用。

3.5 改善能量代谢 正常情况下，心肌细胞的能量供应来源于脂肪酸(60%～90%)和葡萄糖(10%～40%)。在缺血缺氧时，心肌为了适应有限的氧气供应，优化能量供应比例以保证细胞存活。因此，缺血上调葡萄糖的摄取和糖原分解，下调线粒体的脂酸氧化。同时，细胞对改变能量底物供应作出的调节是促使葡萄糖转运蛋白(GLUT-4)表达和转位，脂肪酸转运蛋白(FAT/CD36)则相反[41]，因此增加心肌葡萄糖的利用可改善能量供应，有助于心肌功能恢复。心肌I/R后，出现胰岛素抵抗现象，伴有GLUT-4表达下降和转位障碍，导致细胞外的葡糖糖不能很好的进入胞内被利用，胰岛素生理作用降低。正因如此，作为治疗糖尿病的经典药物罗格列酮，在心肌缺血再灌注损伤中能明显改善胰岛素抵抗现象[42]。同时，通过si-RNA沉默缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)[43]和PPARγ[44]，均发现沉默组较之模型组，GLUT-4表达及转位障碍更加明显，胰岛素抵抗程度加重，心肌细胞死亡率增高；而SIRT1可以通过脱乙酰化HIF-1α[45]和PPARγ[27]来改善缺血缺氧损伤。那么心肌I/R后SIRT1是否通过PPARγ或者HIF-1α来调控GLUT-4的表达和转位？以及如何调控？这些都尚未见报道，值得进一步研究。

同时，线粒体作为心肌细胞能量底物氧化代谢的场所，在调节能量代谢方面也相当重要。Ma等[46]观察到在糖尿病小鼠体内出现胰岛素抵抗、葡萄糖代谢异常、线粒体受损，而这些改变可被白藜芦醇逆转；随后，在慢病毒转染的小鼠和特异性SIRT1敲除(SIRTKO)小鼠中均发现H9c2心肌细胞凋亡比例增高、线粒体膜电位降低、线粒体复合物Ⅳ酶活性降低、ATP生成减少，而这些似乎都与SIRT1通过PGC-1α的去乙酰化、调节下游蛋白NRF-1、NRF-2、ERR-α和TFAM来改善线粒体动力学有关。同时在其他人的研究[22，47]中也证实了这一结果，还有报道发现SIRT1能抑制线粒体自噬保护心脏免受I/R损伤[48]，这也印证了MIRI各发生机制之间相互联系，牵一发而动全身。上述机制总结见图。

图1 SIRT1在心肌缺血再灌注中的作用通路

4 展望

越来越多的证据表明SIRT1可以保护心脏免受衰老和缺血性损伤，刺激内源性SIRT1表达似乎有希望成为降低I/R损伤水平的治疗方向。然而，SIRT1在心脏中的作用仍有许多未解决的问题，主要有以下几个方面：①SIRT1的保护作用是呈剂量依赖性，轻度/过度表达均不能有效保护心脏免受I/R损伤，高水平的表达甚至是有害的[5]。因此，必须确定SIRT1的最佳表达水平，以达到最大的治疗效果。②NAD+/NADH在心脏中的调节机制尚未完全了解。Sirtuins和NAD+之间的偶联以及SIRT1与心脏线粒体和其他NAD+消耗酶(如Poly[ADP-核糖]聚合酶1)之间的相互作用还需进一步研究。③SIRT1通过对关键转录因子如PPARγ和PGC-1α的脱乙酰化的影响以及SIRT1介导的葡萄糖和脂肪酸代谢变化对I/R损伤的影响还有待阐明。④阐明SIRT1相关的下游靶点有助于开发更有效的药物来保护心脏免受I/R损伤。可见，想要更加透彻的了解SIRT1在心脏细胞生物学中的作用，将其转化为治疗心肌缺血性损伤有价值的靶点，还有很长的路要走。