桑叶乙醇提取物的体外抗氧化与抑菌活性

高欣妍， 王海英*， 刘志明

(1.东北林业大学 林学院， 黑龙江 哈尔滨150040； 2.东北林业大学 材料科学与工程学院， 黑龙江 哈尔滨150040)

桑(MorusalbaL.)是一种多年生落叶乔木或灌木，荨麻目桑科桑属(Morus)[1]。桑作为具有经济效益的古老树种之一，不断被人类筛选并培育。桑属有约16种，我国约有11种，常见并普遍利用的包括鸡桑、鲁桑、山桑等几个桑种，东北、西南和西北各省均有桑树种植基地[2-3]。桑叶、桑椹、桑白皮、桑枝、桑木等均可利用。其中，桑叶为国家卫生部药食同源名录的品种，来源于植物桑(M.alba)[4-6]，桑叶在饮品方面可做桑叶茶、桑叶饮料等[7-8]，目前市场上还有桑叶米酒和桑叶啤酒等酒制品[9]，在食用方面，桑叶还被制成桑叶鲜菜和桑叶菜干销售[10]。桑叶含有生物碱类化合物、黄酮类化合物、多糖类化合物等，具有降血脂、降血糖、抗氧化、抑菌和增加机体免疫力等功效[11-13]，因此也被应用于保健品和药物中，用于治疗糖尿病和防治粥样动脉硬化等疾病[14-15]。薛婷婷等[16]采用乙醇浸提法提取新鲜桑叶中的1-脱氧野尻霉素，较佳提取工艺条件为乙醇体积分数65%，pH值3.5，料液比1∶11(g∶mL)，水浴温度55 ℃，经检测此方法获得的桑叶提取物中1-脱氧野尻霉素质量浓度为0.028 g/L，1-脱氧野尻霉素得率为0.065%。桑叶提取物作为一种纯天然植物原料，具有抗氧化与抑菌活性良好的优点，本研究以桑叶为原料，乙醇为溶剂，测定桑叶乙醇提取物的体外抗氧化活性以及对3种常见细菌的抑菌活性，以期为桑叶中活性物质的利用提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

干桑叶由黑龙江省齐齐哈尔市甘南县甘南林场桑产业科技示范园提供，研磨过筛，取粒径≤0.30 mm的部分，备用。

大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)均由东北林业大学实验室提供。

甲醇，色谱纯；铁氰化钾、三氯化铁、三氯乙酸、二苯基苦基肼自由基(DPPH·)、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸亚铁、水杨酸、无水乙醇、氯化钠均为分析纯。

722型可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；索氏提取装置，定制；RE-2000A型旋转蒸发仪，巩义市予华仪器有限责任公司；7890A-7000B型气相色谱-质谱联用仪，美国Agilent公司。

1.2 桑叶乙醇提取物的制备和GC-MS分析

称取5 g干桑叶粉末于圆底烧瓶中，加入50 mL体积分数70%的乙醇，70 ℃水浴回流浸提3 h，过滤残渣，45 ℃、0.9 kPa条件下旋转蒸发，减压蒸馏回收乙醇至质量恒定，得到提取物浸膏，称量所得提取物质量，计算得率。用甲醇将桑叶乙醇提取物配制成10 mg/L的甲醇溶液，利用气相色谱-质谱(GC-MS)联用仪对试样进行分析，色谱和质谱分析条件如文献[17]所示。真空干燥剩下的提取物浸膏得到桑叶乙醇提取物粉末，密封，4 ℃冷藏，备用。

1.3 桑叶乙醇提取物抗氧化实验

1.3.1铁离子还原的总还原力测定 根据文献[18]记载，还原性物质会将铁氰化钾还原，并与三价铁离子形成普鲁士蓝，普鲁士蓝合成量越大，则表明还原性越强。普鲁士蓝在紫外光700 nm处有吸收峰，因此吸光度与还原性强度成正比，吸光度越大，则表示还原性越强。取1 mL不同质量浓度(4.8、3.6、2.4、1.2、0.6、0.3、0.15和0.075 g/L)的桑叶乙醇提取物样液于试管中，分别加入2.5 mL 0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液(pH值6.6)和2.5 mL 质量分数为1%的铁氰化钾溶液，混匀后于50 ℃水浴保温20 min，快速冷却，再加入2.5 mL 质量分数为10%的三氯乙酸，离心，取上清液2.5 mL加入干燥试管，再依次加入2.5 mL蒸馏水、0.5 mL 质量分数0.1%的三氯化铁试剂，充分混匀，倒入比色皿，采用紫外分光光度计在700 nm下测吸光度值(无水乙醇作空白调零)。每个浓度平行操作 3 次，记录吸光度值，取平均值。抗坏血酸作为阳性对照组，设置8组质量浓度梯度，分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0和4.0 g/L。

1.3.2DPPH自由基清除能力测定 向试管中移取 2 mL不同浓度的桑叶乙醇提取物样液，加入2 mL浓度为0.1 mmol/L的DPPH·试剂，混匀后常温放置 15 min，转入比色皿，测定517 nm下的吸光度值(Ai)。测量并记录2 mL不同浓度样液混合2 mL 无水乙醇的吸光度值(Aj)， 和2 mL 0.1 mmol/L DPPH·试剂混合2 mL 的无水乙醇的吸光度值(A0)。以 2 mL 蒸馏水与 2 mL无水乙醇混合液作空白对比。每个浓度测 3 次取平均值，抗坏血酸作为阳性对照组，浓度梯度同1.3.1节。根据以下公式计算不同浓度桑叶乙醇提取物对 DPPH·的清除率(RDPPH·)：

1.4 桑叶乙醇提取物抑菌实验

1.4.1培养基的制备 分别取酵母浸粉5 g、蛋白胨10 g、氯化钠10 g、琼脂25 g于大烧杯中，加入适量蒸馏水，搅拌均匀，定容至1 000 mL，高压蒸汽灭菌(121 ℃时灭菌30 min)，趁热倒入9 cm培养皿中，厚度5 mm，静置凝固后备用。另取一份酵母浸粉5 g、蛋白胨10 g、氯化钠10 g，少量蒸馏水溶解，定容至1 000 mL，高压蒸汽灭菌，制成液体培养基，用于培养菌液。

1.4.2菌悬液的制备 用超净台紫外灯灭菌30 min。取3个100 mL锥形瓶，装入少量无菌的液体培养基，分别用接菌环均匀刮取少量已经活化2～3代的枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌置于锥形瓶中，封口放入摇床，160 r/min晃动，混匀，制成含菌数约106～107CFU/mL的菌悬液。培养完成后，放在冰箱中备用。

1.4.3抑菌实验及数据处理 采用滤纸片法和琼脂平板扩散法进行抑菌实验。将桑叶乙醇提取物配制为8个浓度梯度，将已灭菌的6 mm滤纸片分别放入8种浓度梯度的桑叶乙醇提取物样液中浸泡1 h。移液枪取100 μL上述制备的菌悬液均匀涂抹在琼脂平板表面，制成大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌3种含菌平板。取浸泡过桑叶乙醇提取物的6 mm滤纸片贴在含菌平板上，每个培养皿各3片浸过同一种浓度样液的滤纸片。以蒸馏水为空白对照组。将处理过的含菌平板置于恒温箱中，温度控制在37 ℃，培养24 h后，游标卡尺测量并记录抑菌圈的直径。整理数据制成表格，通过Excel和SPSS19.0计算半数抑制浓度(IC50)及显著性差异。

2 结果与分析

2.1 GC-MS分析

采用索氏提取法得到的桑叶乙醇提取物为浅绿色透明液体，得率为1.80%。桑叶乙醇提取物样品的总离子流色谱图如图1所示，总GC含量90.99%的化合物被鉴定，共鉴定出9种化合物，通过面积归一化法计算出各组分的GC含量，结果如表1所示。

表1 桑叶乙醇提取物GC-MS分析

从表1可知，桑叶乙醇提取物中主要包括酯类(82.85%)、烷烃类(6.31%)、芳烃类(1.62%)、醇类(0.21%)。其中，GC含量最高的为乙酸丁酯(81.55%)，其次为十一烷(6.09%)。

2.2 抗氧化活性分析

2.2.1总还原力测定 铁离子还原法(FRAP法)测定总还原力的本质是测定样品将Fe3+还原成Fe2+的能力，Fe2+络合物在700 nm紫外光照射下有吸收峰，吸光度越大，反应出样品总还原能力越强。桑叶乙醇提取物总还原力如图2所示。

图1桑叶乙醇提取物的总离子流色谱图

Fig.1Totalioncurrentchromatogramofethanolextractfrommulberryleaves

图2桑叶乙醇提取物总还原力

Fig.2Totalreducingpowerofethanolextractfrommulberryleaves

由图2可见，吸光度值与桑叶乙醇提取物质量浓度呈现出良好的正向相关性，随着桑叶乙醇提取物质量浓度的增加，总还原力随之增大。通过Excel拟合曲线得到回归方程为y=0.411 3x+0.364 1，相关系数(R2)为0.986 4。本次试验中的阳性对照组抗坏血酸总还原力在0.1～1.0 g/L质量浓度区间内与其质量浓度呈良好的线性关系，拟合曲线为y=0.63 1x+2.450 6，R2为0.988 9，抗坏血酸在低质量浓度0.1 g/L时吸光度值为2.506，仍大于本次试验中桑叶乙醇提取物最高质量浓度4.8 g/L时的吸光度值2.293。由数据可以看出桑叶乙醇提取物具有较好的还原能力，但仍弱于抗坏血酸。

2.2.2DPPH自由基和OH自由基清除能力 测定了桑叶乙醇提取物和抗坏血酸在体外对于常见的DPPH自由基和OH自由基的清除能力，结果如表2所示。

表2 样品的自由基清除率

由表2可知，桑叶乙醇提取物对于DPPH自由基和OH自由基都有较好的清除能力，相同质量浓度下，桑叶乙醇提取物对DPPH自由基的清除能力明显高于OH自由基。根据表2数据显示，桑叶乙醇提取物在质量浓度大于3.6 g/L时，对DPPH自由基的清除能力接近于完全清除。通过SPSS19.0统计计算，清除DPPH自由基和OH自由基的半数抑制浓度(IC50)分别为73.07和104.52 mg/L。本次对照实验组中，抗坏血酸质量浓度为0.2 g/L时对DPPH自由基清除率即达到96.07%，质量浓度超过1.0 g/L时清除率均在99%以上，接近于完全清除，IC50为0.02 g/L；而对羟基自由基清除率稍弱，质量浓度为4.0 g/L时仅为59.90%，IC50为3.596 g/L。由此可见，桑叶乙醇提取物对DPPH自由基清除能力弱于抗坏血酸，而对羟基自由基的清除能力强于抗坏血酸。有待进一步研究。

2.3 抑菌活性分析

大肠杆菌属于革兰氏阴性菌，金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌属于革兰氏阳性菌，均是常见致病细菌。桑叶乙醇提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌3种供试菌的抑制情况如表3。抑制率通过如下公式计算：

相对抑菌率=(处理组抑菌圈直径-空白组抑菌圈直径)/处理组抑菌圈直径×100%

由表3可知，桑叶乙醇提取物对于3种细菌均有一定抑制作用，随质量浓度的增大，抑菌圈逐渐增大。通过SPSS19.0统计桑叶乙醇提取物与抑制率的关系，计算桑叶乙醇提取物对3种细菌的IC50，比较三者差异的显著性。桑叶乙醇提取物对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的IC50值分别为4.824、6.806和14.382 g/L。结果显示，桑叶乙醇提取物对枯草芽孢杆菌的抑制效果明显高于对大肠杆菌的抑制效果，略高于对金黄色葡萄球菌的抑制效果。在桑叶乙醇提取物质量浓度为19.2 g/L时，对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌直径分别为(15.54±0.85)、(14.03±0.11)和(11.96±0.92) mm，在桑叶乙醇提取物质量浓度小于0.3 g/L时，对3种供试菌的抑制作用明显减弱，几乎没有抑菌圈。

表3 桑叶乙醇提取物的抑菌活性

1)同行不同大写字母表示差异显著different uppercase letters in the same row indicated significant difference

3 结 论

3.1采用索氏提取法对干桑叶进行提取得到乙醇提取物，并对桑叶乙醇提取物的组分进行了研究。结果表明：桑叶乙醇提取物中含有多种有机物，主要包括酯类(82.85%)、烷烃类(6.31%)、芳烃类(1.62%)、醇类(0.21%)。其中，GC含量最高的为乙酸丁酯(81.55%)，其次为十一烷(6.09%)。

3.2对桑叶乙醇提取物的总还原力以及对DPPH自由基和OH自由基的清除能力与阳性对照的抗坏血酸相比，桑叶乙醇提取物的总还原力与清除DPPH自由基的能力较弱，清除OH自由基的能力较强，桑叶乙醇提取物其抗氧化活性与抑菌活性均与其质量浓度呈正相关。桑叶乙醇提取物质量浓度超过3.6 g/L时，DPPH自由基清除率达到99%，其IC50为73.07 mg/L；若要达到更高的羟基清除率，则需要更大的桑叶乙醇提取物浓度，其IC50为104.52 mg/L。

3.3对桑叶乙醇提取物的抑菌效果进行研究，结果表明：桑叶乙醇提取物对3种细菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草牙孢杆菌)均表现出了一定的抑制作用，抑菌效果随桑叶乙醇提取物质量浓度的增加而增强，抑制能力为枯草芽孢杆菌>金黄色葡萄球菌>大肠杆菌。桑叶乙醇提取物质量浓度19.2 g/L下，对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌圈最大，抑菌圈直径分别为(15.54±0.85)、(14.03±0.11)和(11.96±0.92) mm。桑叶乙醇提取物对3种细菌的半数抑制浓度IC50分别为4.824、6.806和14.382 g/L。