三甲胺表征缢蛏贮藏过程中新鲜度变化的研究

冉 云， 张思嘉， 冉照收， 徐继林， 廖 凯

(宁波大学 海洋学院， 宁波 315211)

缢蛏(Sinonovaculaconstricta)是常见的海鲜食材，营养物质丰富，蛋白质占干重的50%以上，具有丰富的不饱和脂肪酸，特别富含淡水贝类缺乏的DHA、EPA等人体生长必需的营养物质[1-2]，已成为东南沿海的主要海水贝类养殖品种。缢蛏通常是在鲜活状态下食用，经蒸煮可产生麦芽酚、DMHF杂环类等物质使之具有清甜、焦香味[3]。但在死亡状态下，由于内外源蛋白酶的分解、细菌繁殖以及生化反应的发生，蛏肉组织会迅速发臭，以致不能食用[4]。其中三甲胺作为腐败气味关键性成分，在腐败的海产品中极为常见，目前三甲胺已经作为多种水产品新鲜度的判定参数[5-10]。因此，本文通过测定缢蛏在-20℃、4℃、26℃贮藏条件下的三甲胺(trimethylamine，TMA)含量变化，为缢蛏贮藏过程中的保鲜提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

在宁波宁海新捕捞的带泥缢蛏加冰运回实验室，从中挑选长(7.11±0.18)cm，宽(2.37±0.05)cm的缢蛏，避光置于盐度25 PSU(Practical salinity units，实用盐标)的海水中暂养2 h后，随机选取一部分缢蛏放入保鲜袋中于-20℃冻藏；剩余缢蛏分为两部分，依然置于海水中，温度分别为4℃和26℃。

1.2 仪器与试剂

7890B-7000C气相色谱-三重四级杆质谱联用仪 (美国安捷伦仪器公司)；顶空进样系统 (德国Gerstel公司)；VOCOL色谱柱(60 m×0.32 mm，0.18 μm, 美国Supelco公司)；分散机(T10基本型，不锈钢材质，锯齿形分散刀具，德国IKA公司)。

标准三甲胺盐酸盐(纯度≥98%，国药集团化学试剂有限公司)；氢氧化钠(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；三氯乙酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

标准溶液配制：称取三甲胺盐酸盐标准品0.0810 g，溶解在5%的三氯乙酸溶液中，定容至500 mL，相当于浓度100 μg/mL的三甲胺标准储备液，然后用5%的三氯乙酸溶液逐级稀释成浓度分别为2.0、1.0、0.5、0.2、0.1、0.05和0.02 μg/mL的三甲胺标准使用溶液。

样品制备：参照国标GB5009.179—2016《食品中三甲胺的测定》，将3种贮藏温度下的缢蛏分别取样(-20℃的样品先解冻)，去壳后在自然状态下吸干多余水分，称取约5 g(精确至0.001 g)样品于50 mL的塑料离心管中，然后加入10 mL的5%三氯乙酸溶液，用分散机将其混合均匀后，以4000 r/min离心5 min，在玻璃漏斗上用三层滤纸将上清液滤入25 mL容量瓶，残留物再分别用8 mL和5 mL 5%三氯乙酸溶液重复上述提取过程2次，合并滤液并用5%三氯乙酸溶液定容至25 mL进行顶空气相色谱-质谱联用分析，每组3个平行。

1.3.2 顶空进样条件

标准溶液顶空处理：分别取各浓度标准溶液2.0 mL于20 mL顶空瓶中，拧紧瓶盖，用医用塑料注射器准确注入5.0 mL 50%氢氧化钠溶液，上机检测。

三甲胺提取液顶空处理：准确吸取2.0 mL提取液于20 mL顶空瓶中，拧紧瓶盖，用医用塑料注射器准确注入5.0 mL 50%氢氧化钠溶液，上机检测。

顶空进样：将制备好的试样在40℃平衡40 min，然后用Gerstel 2.5 mL自动进样针抽取顶空瓶内液面上方的气体250 μL，注入气相色谱(GC)-质谱(MS)联用分析系统中进行测定。

1.3.3 GC-MS检测条件

GC条件：VOCOL色谱柱(60 m×0.32 mm×0.18 μm)；载气为高纯氦气，流量1.6 mL/min。升温程序：柱起始温度40℃，保持3 min，以30℃/min升至200℃，保持1 min；采用分流进样模式，分流比为25∶1。

MS条件：电子轰击(EI)离子源；电子能量70 eV；离子源温度230℃。扫描方式为选择离子扫描(SIM)，所选离子质荷比分别为42、58和59。

1.3.4 数据的处理与分析

定性测定：以样品溶液中三甲胺的保留时间(RT)、定量离子(m/z 58)、辅助定性离子(m/z 59和m/z 42)定性，并以试样溶液中三甲胺的辅助定性离子和定量离子峰度比(Q样品)与标准溶液中三甲胺的辅助定性离子和定量离子峰度比(Q标准)进行比较(相对偏差控制在±15%以内)辅助定性。

定量测定：用外标法定量。纵坐标为标准溶液中三甲胺的峰面积，横坐标为标准溶液中三甲胺的浓度，以此绘制校准曲线计算试样溶液中三甲胺的浓度。

2 结果与分析

新起捕的带泥缢蛏两片贝壳闭合紧密，足部和水管伸缩灵活，肌肉白嫩坚实，手感爽滑、极富弹性。常温26℃下在海水中静养1 d之后，缢蛏活跃度有所下降，2 d后则已死亡，贝壳关闭不紧甚至有的已经张开，足和水管失去伸缩能力，肉质灰暗比较松散，手感黏滞、弹性很差并散发出腥臭味。4℃下缢蛏在海水中静养，从第1天到第4天，除了活动能力减弱，其他未见明显变化；但到第8天时，已彻底失去活动能力，肌肉仍有弹性，无异味，对外界刺激无任何反应。-20℃冻藏缢蛏，从第1天到第30天，未发生明显感官变化。从上述缢蛏的感官变化可以发现，在常温26℃和4℃冷藏条件下，随着时间的增长，缢蛏的生命力在逐渐下降，为了更客观、灵敏地表述这种变化，本研究采用检测三甲胺含量来表征缢蛏贮藏过程中的新鲜度。

三甲胺有鱼腥恶臭，是一种污染物质，对人的眼、鼻、咽喉和呼吸道有刺激作用，常用作评价鱼类新鲜度的一个指标，最早发现是由微生物分解甜菜碱、胆碱和氧化三甲胺而来[11]。有研究认为：新鲜活体中三甲胺以氧化物的形式存在，用于维持肌肉细胞正常生理功能，当生物体死亡后，体内的还原酶将三甲胺氧化物分解为三甲胺，从而释放出刺鼻气味；另外，生物体内的卵磷脂在微生物作用下也会分解产生三甲胺[12]。本实验测定了常温26℃、4℃冷藏以及-20℃冻藏条件下三甲胺含量随贮藏时间的变化(表1)。

表1 不同贮藏条件下缢蛏中三甲胺含量变化

结果表明，新采捕的带泥缢蛏，在自然净化2 h后第一次取样检测三甲胺浓度最低(0.322 mg/kg)。随着时间的增长，3组置于不同温度下的缢蛏三甲胺含量都呈上升趋势：常温26℃条件下从2 h到24 h，三甲胺含量增加较慢，而从24 h到48 h则急剧增多，48 h时死亡腥臭的缢蛏检测到的三甲胺含量已高达13.954 mg/kg；4℃下养在海水中的缢蛏到第4天时仍然存活，三甲胺含量虽有所上升但增速较缓，第8天时缢蛏已失去生命活力，此时测得的三甲胺含量已经上升到1.369 mg/kg；而在-20℃下贮藏的缢蛏，三甲胺含量上升趋势比较缓慢，贮藏30 d时浓度仅为0.564 mg/kg。

可用于评价水产品贮藏过程中鲜度的指标有挥发性盐基氮(TVB-N)、三甲胺(TMA)、菌落总数(TVC)、产硫化氢细菌及假单胞菌数等，在用三甲胺表征水产品新鲜度或腐败情况时，有研究提出100 mg/kg为鱼类三甲胺含量的上限[13]，当然有些生物品种的限量会低于此标准，比如小黄鱼三甲胺含量超过35 mg/kg时，鱼肉就开始腐败变质[14]，这可能与生物体生长环境及菌群差异有关[15-17]。但这些数值显然不适用于缢蛏。由表1可见，4℃下缢蛏完全失去活动能力时三甲胺的浓度也只有(1.369±0.008) mg/kg，所以对于缢蛏而言，用三甲胺表征新鲜度时其浓度值以小于1.3 mg/kg为宜。缢蛏三甲胺上限远低于鱼类的原因，可能跟贝类蛋白质组成跟鱼类有着明显的差异[18-19]以及共生菌群存在差异有关[20-21]。

随着贮藏时间的加长，缢蛏在微生物的作用下，蛋白质、氨基酸和体内其他含氮物质被逐渐分解，产生三甲胺、氨、组胺、硫化氢和吲哚等产物，这是造成缢蛏腐败变质继而散发出腥臭味的主要原因。这些微生物多为腐败细菌，主要来自水中，有假单胞菌属、小球菌属、产硫化氢菌属等[22]。而低温条件不利于此类细菌的生长，表1也表明缢蛏中三甲胺的增长明显受到低温的抑制，可见低温有利于维持缢蛏的新鲜度。

3 结论

本研究为缢蛏贮藏过程中新鲜度的变化提供了理论参考。三甲胺的总量随贮藏时间加长而不断增加，常温26℃条件下增长较快，随着缢蛏死亡而急剧增加，带有刺鼻的腥臭味，细菌腐败是造成缢蛏变质发臭的主要原因；4℃低温冷藏情况下三甲胺含量增加缓慢，低温抑制了腐败微生物的生长繁殖；-20℃低温冻藏在30 d时，三甲胺含量依然很低，相对来说缢蛏依然处于比较新鲜的状态。