苦参双功能核酸酶1的体外表达及结构性质分析

赵德蕊， 廖 怡， 刘苗苗， 杨青山， 吴家文

(1. 安徽中医药大学 研究生院， 合肥 230012； 2. 安徽中医药大学 新安医学教育部重点实验室科研实验中心， 合肥 230038； 3. 安徽中医药大学 药学院， 合肥230012； 4. 安徽道地中药材品质提升协同创新中心， 合肥 230038； 5. 安徽省中医药科学院， 合肥 230038)

核酸酶分为核酸外切酶和核酸内切酶两大类，限制性核酸内切酶能特异性识别切割双链DNA上的特异核苷酸序列，又分为I、II和III 3种类型；I型和III型核酸内切酶不仅能特异性切割核酸，而且能对特殊碱基进行甲基化修饰，其中I型核酸内切酶切割位点距离识别位点可达数千个碱基之远；而III型核酸内切酶切割位点距离识别位点只有25个碱基对左右。II型核酸内切酶只具有识别切割的功能，不能对碱基进行修饰，所识别的多为短的回文序列，所切割的碱基序列即为所识别的序列。本实验克隆表达的苦参双功能核酸酶1 (Sophoraflavescensbifunctional nuclease 1,SfBFN1) 属于I型核酸内切酶，具有降解核糖核酸和脱氧核糖核酸的双重功能[1]，故称为双功能核酸酶1。

早期研究发现动物的核糖核酸酶具有抗肿瘤活性，如豹蛙的核糖核酸酶可以治疗恶性胸膜间皮瘤，对该蛋白的研究已进入III期临床试验[2-5]； 牛精液核糖核酸酶具有抗癌细胞增殖和促进癌细胞凋亡的作用[6]。植物核酸酶1也同样具有抗肿瘤作用，如黑松花粉细胞外核酸酶1[7]和绿豆核酸酶1[8]都能使无胸腺小鼠体内黑色素肿瘤缩小。Matousek等[9]克隆纯化了番茄的双功能核酸酶1，将这种酶及聚乙二醇修饰的化合物注射到无胸腺雌性小鼠体内，并测试其抗癌活性，均可抑制小鼠体内人黑色素瘤或前列腺癌的生长。静脉注射蛇麻的双功能核酸酶1到小鼠体内，发现黑色素瘤或前列腺癌的生长也明显受到抑制[10]。

苦参(SophoraflavescensAit.)为豆科植物，其干燥根具有清热燥湿等功效，外治滴虫性阴道炎[11]；还具有抗肿瘤、镇痛等作用[12-14]。近年来，双功能核酸酶1基因已经从拟南芥[1]、番茄[9]和蛇麻[10]等植物中成功被克隆，但未见苦参双功能核酸酶1基因的研究报道。本实验基于转录组测序利用苦参的功能基因资源，首次通过RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)技术扩增了SfBFN1基因的开放阅读框(Open reading frame, ORF)，构建了SfBFN1的克隆及表达载体，筛选了SfBFN1蛋白最适宜的体外表达条件，分析了SfBFN1蛋白的理化性质、结构特点，为其开发成为抗癌蛋白质药物制剂奠定了实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苦参(SophoraflavescensAit.)植株采自安徽中医药大学药物园，由杨青山副教授鉴定。DNA凝胶提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit和E.Z.N.A Plant RNA Kit购自德国OMEGA公司；酶制剂购自日本TaKaRa公司；引物合成及测序服务由上海生工完成。

1.2 菌株和载体质粒

大肠杆菌DH5α，pET22b(+)和pMD19T载体质粒均购自TaKaRa生物公司； 表达菌株BL21购自北京索宝生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 苦参总 RNA 的提取及 cDNA 合成

取苦参适量叶片，液氮速冻后研磨成粉，利用RNA提取试剂盒提取苦参总RNA。以Random为引物，通过逆转录试剂盒合成cDNA。

1.3.2SfBFN1的克隆

利用软件Primer 5.0设计引物(SfBFN1-F：5′-ATGGGTTCTCTGAAAGGACCAATTGTTTG-3′，SfBFN1-R：5′-AAGTGTCCAGGATCTGTTCACGTTTTTTCC-3′)。25.0 μL RT-PCR反应体系中16.0 μL ddH2O，2.5 μL 10×PCR buffer(Mg2+)，1.0 μL dNTP mixture(10 mmol/L)，1.0 μL 5.0 μmol/μL上下游引物，2.0 μL cDNA和1.5 μL rTaq酶。PCR 扩增程序为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，40℃退火30 s，72℃延伸1 min，共10个循环；随后94℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，共25个循环；最后72℃再延伸10 min。

1.3.3SfBFN1克隆重组质粒构建

将纯化的SfBFN1基因片段连接到pMD19T载体，利用菌液PCR鉴定阳性克隆，NdeI /XhoI酶切鉴定质粒。

1.3.4SfBFN1表达重组质粒构建

将酶切后纯化的SfBFN1基因片段连接到pET22b (+) 空载体，鉴定方法同上。

1.3.5重组质粒 pET22b-SfBFN1在大肠杆菌内诱导表达

将重组质粒pET22b-SfBFN1扩大培养，37℃培养至OD600为0.6，再分别加入不同浓度的IPTG(IPTG浓度分别为0、0.1、0.5和1.0 mmol/L)，在不同温度及时间下分别诱导蛋白表达(16℃诱导24 h、25℃诱导8 h和37℃诱导6 h)。

1.3.6 蛋白Western Blot检测

SDS-PAGE电泳结束后，采用200 mA恒流转膜2 h及37℃封闭(2 g脱脂奶粉和40 mL PBST)1.5 h，经过4℃一抗(1∶100)孵育过夜和37℃二抗(1∶2500)孵育1 h，最后暗室曝光。

1.3.7 蛋白生物信息学分析

利用序列处理在线工具包The Sequence Manipulation Suite(http://www.bio-soft.net/sms/index.html)将SfBFN1的碱基序列翻译为氨基酸序列。通过ExPASy Protparam[15](http://web.expasy.org/protparam/)和Motif Scan(http://hits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan/)分析SfBFN1蛋白的理化特性及结构域。使用MEGA 5.0[16]软件建立SfBFN1蛋白系统发育进化关系。利用PHYRE2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)软件预测了SfBFN1蛋白的三级结构，利用PyMOL[17-18]软件对SfBFN1蛋白的三级结构进行绘制。

2 结果

2.1 SfBFN1的克隆及重组质粒的构建

利用RNA提取试剂盒获得苦参总RNA，结果如图1-A；mRNA逆转录合成cDNA，利用SfBFN1的引物对其ORF片段进行克隆，结果如图1-B。

将PCR产物与pMD19T载体连接获得重组质粒，菌液PCR及酶切鉴定如图1-C、D。酶切pMD19T-SfBFN1质粒与同样酶切的pET22b(+) 载体连接获得重组质粒，菌液PCR及酶切鉴定如图1-E、F。SfBFN1基因序列及其蛋白质序列信息已投递到GenBank数据库，登录号为MG891836。

A：苦参总RNA 提取，1、2为平行样品；B：SfBFN1基因读码框的克隆；C ：重组质粒pMD19T-SfBFN1菌液PCR鉴定图；D： 重组质粒pMD19T-SfBFN1酶切鉴定图；E：重组质粒pET22b-SfBFN1菌液PCR鉴定图；F：重组质粒pET22b-SfBFN1酶切鉴定图。箭头指示目的条带

图1SfBFN1基因读码框序列的克隆及重组质粒鉴定
Figure 1 The ORF cloning ofSfBFN1 and identification of recombinant plasmids

M: Marker; 1～4 分别代表在 16℃下培养24 h， IPTG 终浓度为0、0.1、0.5和1.0 mmol/L 时的蛋白表达情况；5～8 分别代表在 25℃下培养8 h， IPTG 终浓度为0、0.1、0.5及1.0 mmol/L时的蛋白表达情况；9～12 分别代表在 37℃下培养6 h， IPTG 终浓度为 0、0.1、0.5及1.0 mmol/L时的蛋白质表达情况

图2SfBFN1的诱导表达情况
Figure 2 Expression ofSfBFN1

2.2 重组质粒 pET22b-SfBFN1的诱导表达

将pET22b-SfBFN1转化到BL21感受态细胞中，以不同的IPTG 浓度分别在16℃、25℃和37℃诱导表达，利用Western Blot鉴定目的蛋白的表达情况，结果(如图2)显示：在37℃下，当IPTG的终浓度为0.5 mmol/L时目的蛋白的表达量最多(*标示)。

2.3 生物信息学分析结果

2.3.1SfBFN1序列分析

将SfBFN1的cDNA 序列翻译成蛋白质序列，如图 3 所示：读码框长度为984 bp，编码327个氨基酸，TAA为终止密码子。

图3 SfBFN1的开放读码框序列和氨基酸序列Figure 3 ORF and amino acid sequence of SfBFN1

2.3.2 SfBFN1蛋白理化性质

利用Protparam 在线软件分析SfBFN1蛋白，其分子式C1585H2573N447O466S26，相对分子质量约为36.2 ku，理论等电点8.9，280 nm处的摩尔消光系数为29 045 M-1·cm-1。该蛋白含有30个缬氨酸(Val)，其含量为9.2%；含有41个正电荷氨基酸和33个负电荷氨基酸。

2.3.3 SfBFN1基元及结构域分析

Motif Scan分析显示SfBFN1编码蛋白的基元和结构域信息见表1，主要含有4个N-糖基化位点，4个酪蛋白激酶II磷酸化位点和2个酪氨酸激酶磷酸化位点等。

2.3.4 SfBFN1分子系统进化分析

利用 NCBI中SmartBlast在线软件对SfBFN1编码蛋白进行序列比对；通过MEGA5.0软件对不同物种双功能核酸酶1进行同源进化树分析(图4)，SfBFN1的蛋白序列与羽扇豆、花生及木豆等豆科植物的双功能核酸酶1蛋白序列的同源性约为80%，说明该酶在豆科植物之间具有保守性；其中，SfBFN1与羽扇豆双功能核酸酶1蛋白序列的同源性高达84%，它们之间的遗传距离最短，其亲缘关系最近。

表1 SfBFN1蛋白的基元及功能信息

Lupinusangustifolius(XP_019416686.1)；Arachisipaensis(XP_016167659.1)；Cajanuscajan(XP_020219569.1)；Vignasinensis(XP_014504471.1)；Vignaangularis(XP_017428013.1)；Malusdomestica(XP_008359765.1)；Pyrusbretschneideri(XP_009335956.1)；Arabidopsislyrata(XP_020891185.1)；Brassicaoleracea(XP_013621486.1)；Raphanussativus(XP_018472402.1)；Brassicarapa(XP_009128096.1)；Camelinasativa(XP_010416415.1)

图4 SfBFN1蛋白的系统进化树
Figure 4 Phylogenetic analysis of SfBFN1 protein

图A 中1为二级结构示意图(绿色示意α螺旋，蓝色示意β折叠)；2 为SfBFN1蛋白氨基酸序列；3 为模板TMO160 蛋白(PDB ID: 1sj5)氨基酸序列；4 为模板TMO160 蛋白的二级结构。图B为 SfBFN1的三级结构模型(红色示意α螺旋，黄色示意β折叠)

图5 SfBFN1蛋白结构模型
Figure 5 The structure model of SfBFN1 protein

2.3.5 SfBFN1蛋白结构

本研究利用PHYRE2在线软件预测了SfBFN1蛋白的部分三级结构，氨基酸序列覆盖率为40%(覆盖SfBFN1蛋白132个氨基酸残基，分别为Q123-D142、T144-V211和E214-K257，序列一致性为23%，可信度为100%)。结果显示SfBFN1酶蛋白中央保守区域 (Q123-K257) 富含α螺旋和β折叠，其中含5个α螺旋 (E154-A162、L174-M185、P223-C234、K242-D248和F254-G256) 和7个β折叠(A135-M140、C146-V152、E188-V198、A201-K210、C217-D211、I228-R233和I238-N241)，如图5-A所示。

利用PyMOL软件对SfBFN1的三级结构进行绘制(图5-B，结构区域为Q123-K257)。SfBFN1酶蛋白的三级结构中7个β折叠被5个α 螺旋包裹在内部，构成了蛋白质立体结构的稳定的内部框架。

3 结论与展望

本实验成功克隆了SfBFN1基因的开放阅读框，筛选了SfBFN1蛋白的体外表达条件，分析了其理化性质、同源关系及结构特点。研究发现SfBFN1蛋白与羽扇豆的双功能核酸酶1蛋白之间的遗传距离最短，同源性高达84%，这与苦参是豆科植物是相符的。

植物双功能核酸酶1具有重要的生物学功能[19-20]，如氧响应因子1通过与双功能核酸酶1的启动子结合从而影响拟南芥叶片的衰老[21]，双功能核酸酶1的启动子不仅在衰老的器官中有活性，在其他器官中(如正在发育的花、种子，以及受精后的花等)也有活性，说明该酶还参与拟南芥不同的生长发育过程[22]。

动物核酸酶能抑制和杀死肿瘤细胞，如牛胰腺核糖核酸酶、牛精液核糖核酸酶和豹蛙的核糖核酸酶等，这些酶与细胞的相互作用大多是非特异性的，所以它们的应用会引起较强的毒副作用，例如代谢变化、免疫反应或干扰精子生长等[23-24]。虽然植物核酸酶的功能尚未被广泛发掘，但已证实它具有抗肿瘤作用及较小的毒副反应，其原因可能是动植物具有不同的糖基化模式[9,25]，故植物双功能核酸酶1蛋白作为潜在的抗肿瘤抑制剂引起了越来越多的关注。

通过X射线荧光光谱法发现番茄的双功能核酸酶1 蛋白中锌离子有3种空间排列方式，且该蛋白通过二硫键保持结构稳定，这点与牛精液核糖核酸酶的结构类似[26]。研究还发现番茄、蛇麻及芸苔的双功能核酸酶1蛋白具有桔青霉核酸酶1相似的结构特征，且这三种双功能核酸酶经过N-糖基化修饰后切割双链DNA，该过程由Zn2+催化发生[27-30]。SfBFN1蛋白的三级结构富含α螺旋与β折叠，5个α 螺旋包裹着7个β折叠，构成了稳定的立体结构，且蛋白中含有4个N-糖基化位点(表1)，蛋白质序列中含有10个半胱氨酸，推测此蛋白酶也是通过二硫键保持结构稳定，由Zn2+催化此酶经过N-糖基化修饰后切割双链DNA。本研究为进一步纯化SfBFN1蛋白，将其开发成抗癌药物奠定了实验基础。