建立表达犬NECTIN4的牛源细胞株用于培养犬瘟热病毒

杨思鸣, 蔡东焱, 孙曼曼, 陈 霄, 戴晓峰, 白仲虎

(1. 江南大学 粮食发酵工艺与技术国家工程实验室， 无锡 214122；2. 江南大学 生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室， 无锡 214122；3. 江南大学附属医院 肿瘤科， 无锡 214062)

犬瘟热(Canine distemper, CD)是由犬瘟热病毒(Canine distemper virus, CDV)感染引起的急性、高度接触性传染病，是当前对我国养犬业、毛皮动物养殖业和野生动物保护业危害最大的疫病之一，造成了严重的经济损失[1]。近年来，陆续有不同种动物发生CD的报道，尤其是国宝大熊猫和猕猴等珍稀野生动物受犬瘟热病毒感染致死事件的发生更是引起越来越多的学者对犬瘟热病毒的关注和重视[2-3]。

犬瘟热病毒感染细胞通过病毒囊膜上的H蛋白与被感染细胞表面特异性受体相结合，F蛋白介导膜融合使得病毒可以顺利进入细胞进行复制。因此细胞是否表达能和H蛋白结合的特异性受体是影响细胞敏感性的关键因素[4]。目前已发现犬瘟热病毒有3种受体，分别为CD46(Complement-regulatory protein 46，CD46)[5-6]和黏附连接蛋白(Nectin cell adhesion molecule 4, NECTIN4)[7]，其中NECTIN4分子IgV结构可与犬瘟热病毒H蛋白形成所有犬瘟热病毒受体中最强的结合力[8-9]。

本研究通过克隆犬瘟热病毒受体NECTIN4序列，在MDBK细胞中表达并通过G418筛选获得了稳转细胞株，成功利用牛源细胞培养犬源病毒，为稀有病毒的分离培养提供新的途径，为工业疫苗生产细胞株的开发提供了新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 载体、菌株和细胞

载体pcDNA3.1(+)、克隆菌株DH5α由本实验室保存。细胞系MDBK购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。犬瘟热病毒购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC)。

1.1.2 主要试剂

高保真聚合酶PrimerStar、T4 DNA连接酶(TaKaRa)，限制性内切酶(Thermo)，胶回收试剂盒、质粒DNA小量提取试剂盒(TIANGEN)。

DMEM(Hyclone)、胎牛血清、胰蛋白酶(Gibco)、鲑鱼精(Sigma)、G418(Biosharp)、RNA提取试剂盒(TIANGEN)、反转录试剂盒、SYBR qRT-PCR试剂盒(TaKaRa)、蛋白裂解液RIPA、免疫荧光试剂盒(碧云天)、DAPI(BD)，抗Flag标签的兔多抗、抗GAPDH兔多抗、HRP标记的山羊抗兔IgG抗体、FITC标记的山羊抗兔IgG抗体(Proteintech)，FITC标记的犬瘟热病毒单克隆抗体(VMRD)。

这份按照里帕的引用频次，由保罗·托奇的整理的，长达四页的“所引用的作家目录”索引表，可谓是一个有用的指引，后人从中大致可以得出《图像学》对古代作品的依赖程度的判断。

1.2 方法

1.2.1 犬NECTIN4表达载体的构建

参考GenBank上登录的犬源NECTIN4 mRNA序列(GenBank登录号：NM_001313853.1)，在起始密码子ATG 5′端添加酶切位点EcoR I和Kozak序列：GCCACC，编码序列3′端添加Flag标签、终止密码子TGA和酶切位点XbaI，蛋白编码序列经密码子优化后由上海捷瑞生物有限公司合成，酶切连接到载体pcDNA3.1(+)上，得到质粒pcDNA-DogN4-Flag。

1.2.2 MDBK细胞转染

胰酶消化细胞后使用预冷的PBS洗涤一遍，200 μL PBS重悬2×106个细胞，加入20 μg质粒、10 μg鲑鱼精后置于预冷的2 mm电转杯中，冰浴1 min，使用细胞电穿孔仪350 V、500 μs电击3次，每次间隔1 min。最后使用含10%FBS的DMEM培养基将细胞培养在6孔板中。

1.2.3 稳转细胞株筛选

转染后48 h添加抗生素G418，使终浓度为1400 μg/mL，抗生素筛选一周后使用有限稀释法挑取单克隆，命名为MDBK-N4细胞。

1.2.4 RT-PCR检测稳转细胞株中NECTIN4 mRNA转录水平的表达

使用NCBI网站中Primer-blast功能设计逆转录PCR引物并交由苏州金唯智生物科技有限公司合成。本试验所用的引物见表1。

表1 本试验所用的引物

MDBK细胞(阴性对照)和MDBK-N4细胞接种于6孔板，长至80%～90%汇合度时，利用试剂盒提取细胞的总RNA，取1 μg RNA用反转录试剂盒将其反转录为cDNA，以cDNA为模板，使用逆转录PCR引物通过PCR扩增NECTIN4和GAPDH。PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像仪观察并分析结果。

1.2.5 Western Blot检测NECTIN4的表达

MDBK(阴性对照)和MDBK-N4细胞接种于6孔板，长至80%～90%汇合度时，使用裂解液RIPA裂解细胞，提取蛋白并定量。取30 μg蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并利用电转仪将目的蛋白转印至PVDF膜。转膜后TBST洗膜3次并使用含5%脱脂奶粉的TBST封闭2 h，封闭后TBST洗膜3次使用一抗4℃孵育过夜，一抗孵育后加入TBST洗膜3次使用二抗室温孵育1.5 h，TBST洗膜3次，BCL试剂显色，使用化学发光凝胶成像仪观察。

1.2.6 间接免疫荧光观察NECTIN4和病毒外壳蛋白表达

NECTIN4样品准备。MDBK(阴性对照)和MDBK-N4细胞接种于96孔板，长至50%～60%汇合度时可用于观察NECTIN4的表达，进行间接免疫荧光实验。

病毒外壳蛋白样品准备。细胞长至70%～80%时，PBS洗涤1遍，接种50 μL犬瘟热病毒，1 h病毒吸附完成后，换成2% FBS的DMEM培养基培养至细胞出现明显病变后，便可用于间接免疫荧光实验。

间接免疫荧光。样品制备完成后，使用PBS洗涤3次(后面洗涤操作亦同)，加入固定液室温固定10 min，洗涤后通透液室温通透10 min，洗涤后加入含2% 脱脂奶粉的PBS封闭1 h，洗涤后加入一抗室温孵育1 h，再次洗涤后二抗孵育1 h，再次洗涤后DAPI染色10 min，洗涤后使用倒置荧光显微镜观察蛋白的表达情况。

2 结果与分析

2.1 质粒pCDNA-DogN4-Flag的鉴定

限制性内切酶EcoR I和XbaI的双酶切结果显示(图1)，泳道1中5400 bp的条带为被两酶切开的pcDNA-DogN4-Flag质粒骨架，1570 bp的条带为两酶切位点间所连接的NECTIN4片段。

M: DL10000 DNA marker; 1: pcDNA-DogN4-Flag (digested withEcoR I andXbaI)

图1质粒pcDNA-DogN4-Flag的鉴定

Figure 1 Identification of recombinant pcDNA-DogN4-Flag

2.2 MDBK-N4细胞株的鉴定

2.2.1 逆转录PCR检测MDBK-N4细胞株中NECTIN4的表达

逆转录PCR结果显示(图2)，以MDBK-N4细胞(第10代)的cDNA为模板进行PCR，泳道2、4显示NECTIN4和GAPDH均有表达，以MDBK细胞的cDNA为模板，泳道1、3显示只有GAPDH表达。说明MDBK-N4细胞中NECTIN4在mRNA转录水平上有表达。

M: DL500 DNA marker; 1～2: MDBK cells and MDBK-N4 cells forNECTIN4; 3～4: MDBK cells and MDBK-N4 cells forGAPDH

图2逆转录PCR分析MDBK-N4细胞系中NECTIN4 mRNA表达

Figure 2 The expression ofNECTIN4 mRNA detected in MDBK-N4 cells by using reverse transcriptional PCR

2.2.2 Western Blot检测MDBK-N4细胞株中NECTIN4表达

Western Blot结果显示(图3)，相比对照组MDBK细胞，MDBK-N4细胞(第10代)在56 ku处有明显条带，说明MDBK-N4细胞能够稳定表达NECTIN4蛋白。

2.2.3 免疫荧光检测MDBK-N4细胞株中NECTIN4的表达

免疫荧光结果显示(图4)，相比对照组MDBK细胞(图4-A)，MDBK-N4细胞(第10代，图4-B)中NECTIN4(绿光)有表达，且主要分布在细胞膜周围，围绕细胞核(蓝光)，说明MDBK-N4细胞能够稳定表达NECTIN4，且蛋白转运到细胞膜。

图3 Western blot检测MDBK-N4细胞NECTIN4蛋白的表达

A: MDBK cells; B: MDBK-N4 cells

图4免疫荧光检测MDBK-N4细胞中NECTIN4的表达(单细胞放大图)

Figure 4 Expression of NECTIN4 detected in MDBK-N4 cells by fluorescent microscope (Enlarge for single cell)

2.3 免疫荧光检测病毒感染后的MDBK-N4细胞

免疫荧光结果显示(图5)，受到犬瘟热病毒感染3 d后，MDBK-N4细胞(第10代)产生了明显病变现象，部分凋亡脱落，大部分细胞拉丝，病毒外壳蛋白(绿光)分布在细胞内部，说明MDBK-N4细胞表达的NECTIN4发挥了病毒受体的功能，犬瘟热病毒在细胞内复制增殖产生了子代病毒，随后感染周围细胞，引起大量细胞凋亡。

A: MDBK cells; B: MDBK-N4 cells

图5免疫荧光检测细胞中犬瘟热病毒的蛋白外壳(×20)

Figure 5 Envelope protein of canine distemper virus detected in MDBK-N4 cells by fluorescent microscope (×20)

3 讨论

NECTIN4是一个黏附分子，既参与上皮组织的内皮连接，也能够作为单纯疱疹病毒的受体，近年来，随着对NECTIN4研究的深入，发现其也能作为麻疹病毒属病毒的受体，例如充当犬瘟热病毒的受体[7, 11]。此外，NECTIN4属于免疫球蛋白超家族，与脊髓灰质炎病毒受体(Poliovirus receptor，PVR)同源，因此又被称为PVRL4[12]。

关于表达外源受体的研究很多，以犬瘟热的另一个受体SLAM蛋白为例，有报道在猴肾Vero细胞和犬细胞上表达SLAM蛋白能增强细胞对犬瘟热病毒的分离能力[13]，但是此前已经有关于Vero细胞能够分离犬瘟热病毒的报道了，表达受体仅仅增强了Vero细胞对野生新突变的犬瘟热病毒株的分离能力[14]。此外，亦有学者在超越病毒宿主范围的细胞株上进行表达受体建立稳转细胞株的研究[15]，但是并未证明细胞对病毒的敏感性发生改变。本研究的创新之处在于证明表达受体可以拓展病毒的宿主范围，令牛肾细胞接受犬瘟热病毒的感染。笔者推测，由于病毒的侵染复制的方式多种多样，需要与宿主细胞多个蛋白的相互作用。有些蛋白在物种间具有高度保守性，例如负责mRNA转录翻译和免疫相关功能等，但是能够帮助病毒吸附和入侵的受体蛋白却具有特异性，因此没有一株病毒可以感染所有宿主。然而，受体蛋白也许是限制病毒侵染细胞的因素之一，绝非全部，否则关于此方面的研究应该有很多。表达了犬NECTIN4蛋白的MDBK-N4细胞株能够发挥犬NECTIN4作为内化受体的功能[11]，成功让犬瘟热病毒侵染到细胞内并完成复制增殖的过程说明病毒进入细胞后MDBK细胞中再无明显限制犬瘟热病毒复制增殖的因素。这一试验证明对于一些缺乏敏感细胞株的病毒，可以尝试运用一些成熟的细胞系通过表达外源受体的方式完成病毒的分离培养和研究[16]。

在疫苗工业中，以犬瘟热病毒疫苗举例，传统的疫苗使用鸡胚繁殖得到的病毒制成，过程无法监测，大规模培养困难，产品质量不稳定[17]。此后部分公司采用Vero贴壁细胞系作为培养犬瘟热病毒的新宿主，受限于贴壁细胞系的性能，即使采用微载体培养，效率和成本也难以和悬浮培养相媲美。此外，微载体培养及其大型生物反应器制造的相关专利仍然掌握在国外几个大公司手中，在国内推广的成本很高[18]。如果运用表达外源受体的方法，便可采用现有具备成熟培养工艺的悬浮细胞，例如CHO工程细胞株完成犬瘟热病毒的培养，其产量、成本、过程的可控性将大大提升，工业前景广阔[19]。此方法不仅可以用于犬瘟热病毒疫苗的生产，亦可用于其他具备明确受体的病毒的培养，满足疫苗工业在开发疫苗新品种时，对具备优良性能细胞株的热切需求[20]。