环境中丙烯酰胺检测方法和健康危害的研究进展

徐文静，付强，谭丽菊,*，张凯奇

1. 中国海洋大学化学化工学院，青岛 266100 2. 盐城工学院环境科学与工程学院，盐城 224051 3. 江苏省水文水资源勘测局，盐城 224002

丙烯酰胺(acrylamide, AM)，分子结构如图1所示，被广泛应用于工业生产[1-2]，具有“百业助剂”之称[3]。生产泄漏的丙烯酰胺会通过废水、废渣和降雨等途径进入土壤和水环境[4]。人们日常生活中使用的化妆品[5]、纺织品、塑料[6]和香烟[7]等，也含有一定量的丙烯酰胺并会随着垃圾一起被弃置于环境中。人们接触丙烯酰胺的重要途径还包括食品摄取[8]。由于丙烯酰胺易溶于水，在碱中易分解，在加热条件下会放出腐蚀性气体和氮的氧化物[9]，因此会产生一定的毒性。丙烯酰胺具有急性、亚急性和慢性毒性，有致突变性、生殖毒性及致癌性[10]。在《欧盟物质和混合物分类、标签和包装法规(CLP)指南》中规定，丙烯酰胺的最大限量为1 000 mg·L-1，属于第2批加入清单的高关注物质[11]。1993年，世界卫生组织(WHO)就将之评估为有致癌风险的物质[12]。1994年，丙烯酰胺被国际癌症研究机构(IARC)定为2A类致癌物，即人类可能致癌物[13]。随着食品安全事件不断发生，近年来各国政府和国际组织对丙烯酰胺十分重视，出台了多项关于丙烯酰胺的法律法规：WHO规定水中丙烯酰胺不能超过1.0 μg·L-1[14]，中国规定饮用水及地表水源地中其标准限值为0.5 μg·L-1；美国职业安全与卫生法(OSHA)规定职业接触空气中丙烯酰胺的阈值为0.3 mg·m-3[15]；各国卫生部门规定聚丙烯酰胺工业产品中丙烯酰胺残留量限值在0.05%～0.5%[4]。这些法规的出台和实施，为减少丙烯酰胺的环境危害提供了法律依据和保障。与之相适应，关于丙烯酰胺分析方法和毒性效应的研究成果不断涌现。本文对环境中丙烯酰胺的检测方法和健康危害研究进展进行综述，并对以后的研究方向进行了展望，旨在为环境中丙烯酰胺的毒性评估和污染防治提供生态毒理学依据，为进一步研究丙烯酰胺提供基础和思路。

1 检测方法(Detection method)

丙烯酰胺分子量小、极性强，没有共轭双键、三键和苯环等发色基团[16]，加上环境中丙烯酰胺浓度较低且易受到其他物质的干扰，因此不能使用常规的分析方法，这给检测造成一定的困难。经过多年的努力和探索，目前已经形成一些行之有效的检测食品和淡水环境中丙烯酰胺的方法，可以总结为以下几种。

图1 丙烯酰胺的分子结构Fig. 1 Molecular structure of acrylamide

1.1 气相色谱法

气相色谱(GC)系列方法，包括气相色谱-质谱法(GC-MS)和气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)，是测定丙烯酰胺常用的方法之一。由于丙烯酰胺遇热不稳定，不能直接进入色谱柱，所以一般需要进行前处理，进行柱前衍生或富集浓缩[17-18]。对于食品等复杂体系，则需要进行萃取、脱脂和去蛋白等操作。张丹等[19]建立了柱前溴化衍生-EI源串联四极杆气质联用法(GC-EI-MS/MS)测定地表水中的丙烯酰胺，该法虽前处理复杂，但定性准确，灵敏度高，稳定性好，检出限为0.03 μg·L-1。除与质谱技术相结合，Sobhi等[20]还成功开发出一种改良的中空纤维液相微萃取(HF-LPME)方法，并结合气相色谱-电子捕获检测技术(GC-ECD)对废水中丙烯酰胺进行了定量分析，该法无需进行预处理，操作简便快速，成本低，同时具有较高的精度和准确性，适合废水中痕量丙烯酰胺的检测。Zokaei等[21]建立了一种超声辅助萃取与分散液液微萃取结合的GC-MS方法，用于测定薯片中的丙烯酰胺，检测限可低至0.6 ng·g-1。

1.2 液相色谱法

高效液相色谱(HPLC)系列方法，包括高效液相色谱-紫外检测法(HPLC-UV)、超高效液相色谱-紫外检测法(UPLC-UV)[22]、高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS)、高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)[23-25]和超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)法，这些方法无需衍生化，检出限可低至2.4 ng·L-1[23]，回收率可达96.7%～105%，可基本消除介质的基质效应[22]，已用于自来水、地表水[26]和地下水等淡水体系中痕量丙烯酰胺的检测。如果水体中的丙烯酰胺浓度过低，还可以采用固相萃取等方法进行快速富集[27]。刘红河等[28]用水提取食品中的丙烯酰胺，经离心和滤膜过滤，采用C18固相萃取小柱对样品进行纯化，在210 nm检测波长用紫外光谱扫描到丙烯酰胺有最大吸收峰。De Paola等[29]将快速样品前处理技术(QuEChERS)和液相色谱-质谱法(LC-MS)结合应用到干果和可食用种子中丙烯酰胺的测定，取得了良好的效果。

1.3 光谱法

紫外-可见吸收光谱法属电子光谱，通过一定波长下的吸光值对丙烯酰胺进行定性、定量和结构分析。郝亚楠等[30]通过紫外分光光度法测定不同食品中丙烯酰胺的含量，结果显示，丙烯酰胺的吸光度与其浓度在0.25～6.0 μg·L-1的范围内呈良好的线性关系。由于丙烯酰胺没有发色基团，很难通过一般的光谱法对其进行测定，但可以通过对其他物质光谱的改变来间接反映其浓度。张罗一览和郑红[31]利用丙烯酰胺对高锰酸钾-甲醛-抗坏血酸体系的化学发光抑制作用来测定水中的丙烯酰胺，效果良好，检出限为5.0 μg·L-1。Gezer等[32]利用可生物降解的蛋白基传感器和表面增强拉曼光谱(SERS)检测丙烯酰胺，发现丙烯酰胺的存在导致了传感器的背景SERS光谱中出现了特征标记峰值，该峰可用于定量检测丙烯酰胺在水溶液中的含量。

另外，食品在通过美拉德反应形成丙烯酰胺的过程中，会伴随食物的着褐色过程。通过对比颜色深浅和丙烯酰胺浓度的关系，可以分析食品中丙烯酰胺的含量，这种方法称为计算机视觉(Computer Vision)法。该法简单易行，不需要前处理，可以及时跟踪食品中丙烯酰胺的含量[33]，对于食品烹饪过程的改进大有裨益。

除了以上通过在紫外光、可见光和拉曼光谱等波段范围内的强度变化，还可通过丙烯酰胺与其他分子生成荧光物质的方法来测定其含量。这些荧光物质一般结合电化学方法，以传感器的形式存在，因此，该部分内容在1.4中介绍。

1.4 电化学法

常用的电化学法是化学传感器的方法。该方法的基本原理为：待检测物与识别元件特异性结合，然后经信号转换器把检测信号转变成电信号来检测。Asnaashari等[34]基于金纳米粒子(AuNPs)和标记双链DNA设计了一种新型生物传感器，在丙烯酰胺存在的情况下，形成单链DNA(ssDNA)和丙烯酰胺加合物，被标记的互补链DNA在金纳米粒子表面的吸附被抑制，导致荧光强度显著降低，通过产生显著的荧光强度差建立了检测方法，该方法具有较高的选择性和广泛的线性响应。Hu等[35]制备了经紫外照射而改性的量子点(QDs)，这种量子点之间的距离会随着荧光强度的降低而减少，进而导致量子点荧光强度发生变化，但丙烯酰胺的存在则会增大量子点之间的距离，以此原理建立了一种新型荧光传感器检测丙烯酰胺。毛禄刚[36]利用金纳米和碳纳米管复合物修饰的凝胶溶胶分子印迹电化学传感器检测食品中的丙烯酰胺，最低检测限达到了0.028 μg·mL-1。Ning等[37]研制了一种磁性石墨烯分子印迹聚合物，可以快速、高选择性地测定加热或油炸食品中的丙烯酰胺。与高效液相色谱法相比，分子印迹电化学传感器具有更好的灵敏度和选择性，成本也更加低廉，未来的实际应用价值会很大。

除了化学传感器的方法，极谱法也被应用于饮用水中丙烯酰胺的检测。Niaz等[38]首次尝试了示差脉冲极谱法(differential pulse polarography, DPP)，该法测定范围为0.2～20.0 mg·L-1，检出限为27.0 μg·L-1，可以排除水中常见物质的干扰。由于电化学方法测定迅速，试剂消耗少，是一种良好的样品测试手段。该工作将电化学方法应用于丙烯酰胺的测定，是有益的尝试。相信随着技术的发展和测定条件的不断完善，电化学法可以用来测定水体中低浓度的丙烯酰胺。

1.5 酶联免疫吸附法

酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)法是目前最理想的残留筛选性分析方法之一，已广泛应用于环境监测等领域。为了提高检测效率，近年来有学者尝试基于抗原-抗体特异性反应来实现对丙烯酰胺快速的定性定量分析。赵美萍等[39]利用ELISA法将N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺(NAS)和载体蛋白分子表面的氨基进行胺解偶联制备抗原，而后在免疫动物上制备特异性识别丙烯酰胺的多克隆抗体，利用这种获得的抗体测定水溶液及食品中丙烯酰胺的含量，同时提供了相应的试剂盒。该方法特异性强、灵敏度高、操作方便，适于快速检测大量样品。然而，如何获得具有高度稳定性和亲和力的丙烯酰胺抗体仍然是未来研究的关键问题[40]。

将以上方法总结于表1和图2。由表1和图2可知，目前关于丙烯酰胺的测定方法基本能够满足食品和淡水中丙烯酰胺的测定需求，但对海水的测定尚未涉及。相信随着科学技术的不断发展，建立更加简单有效的检测环境水体(包括海水)中微量丙烯酰胺的方法，是完全可以实现的。

2 健康危害(Health hazard)

丙烯酰胺具有较强的组织渗透性，其单体可通过皮肤、消化道和呼吸道等多种方式进入生物体内[41]。大鼠经口半数致死剂量(LD50)为124 mg·kg-1；大鼠经皮半数致死剂量(LD50)为400 mg·kg-1；红鳟鱼72 h静态实验研究表明，其对丙烯酰胺的生物富集因子(BCF)为1.65，丙烯酰胺有生物积累的潜在可能性[10]。动力学研究显示，进入体内的丙烯酰胺随着血液可扩散至全身各处[42]，从而危害生物体的健康(表2)。这些危害可归结为如下几类。

2.1 神经毒性

丙烯酰胺作为一种蓄积性的神经毒素[49]，可导致急性、亚急性和慢性中毒[40]。人体长期少量接触丙烯酰胺往往会有一些不良症状，如嗜睡、出现幻觉和记忆改变等，短时间内接触高剂量丙烯酰胺则会使中枢和周围神经轴突的远端肿胀，最终变性，还会渐渐向近端扩展[4]。中毒早期一般会出现肌肉无力、麻木和神经异常等症状，随着中毒时间的延长，中枢神经系统的功能会受到不同程度的损伤，且较难恢复，严重时甚至可导致小脑细胞凋亡，主要表现为活动变缓，应激反应麻木迟钝等[50]。金河天等[46]发现腹腔注射丙烯酰胺的大鼠神经传导速度明显降低；李嘉[43]发现丙烯酰胺能诱发动物出现运动失调、行动迟缓和平衡障碍等类帕金森病(PD)行为学特征。在机理方面，丙烯酰胺会损害神经元(SH-SY5Y)和神经胶质(U-1240 MG)细胞的分化效率[51]，也可能导致神经元Purkinie细胞的损伤[52-54]。另外，丙烯酰胺也可能通过改变大鼠脑内谷氨酸的浓度，导致钙超载，引发神经细胞死亡，最终影响大鼠脑中枢的学习记忆功能[55]，从而产生神经毒性[56]。而且，丙烯酰胺可以造成活性氧(ROS)的累积导致氧化损伤[57]。由分析可见，丙烯酰胺可以通过不同的方式危害生物的神经系统。迄今为止，对丙烯酰胺的神经毒性有3种假设：通过抑制神经突触前端的一氧化碳信号阻止神经传递；直接作用于驱动蛋白以抑制轴突的快速传导；直接抑制神经代谢的相关酶而引发神经病变[58]。

图2 丙烯酰胺的测定方法总结注：HPLC-MS表示高效液相色谱-质谱法；HPLC-MS/MS表示高效液相色谱-串联质谱法；HPLC-UV表示高效液相色谱-紫外检测法；LC-PAD表示脉冲安培检测法；UPLC-MS表示超高效液相色谱-质谱法；UPLC-MS/MS表示超高效液相色谱-串联质谱法；HPLC-UV表示液相色谱-紫外检测法；GC-MS表示气相色谱-质谱法；GC-MS/MS表示气相色谱-串联质谱法；GC-FID表示气相色谱-氢火焰离子化检测法；GC-EI-MS/MS表示柱前衍生-EI源串联四极杆气质联用法；GC-ECD表示气相色谱-电子捕获检测法；QuEChERS-LC-MS表示快速样品前处理技术和液质联用法。Fig. 2 Summary of the determination methods of acrylamideNote: HPLC-MS stands for high performance liquid chromatography-mass spectrometry; HPLC-MS/MS stands for high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; HPLC-UV stands for high performance liquid chromatography-ultraviolet detection; LC-PAD stands for pulse ampere detection; UPLC-MS stands for ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry; UPLC-MS/MS stands for ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; HPLC-UV stands for high performance liquid chromatography-ultraviolet detection; GC-MS stands for gas chromatography-mass spectrometry; GC-MS/MS stands for gas chromatography-tandem mass spectrometry; GC-FID stands for gas chromatography-flame ionization detector; GC-EI-MS/MS stands for gas chromatography-tandem mass spectrometry; GC-ECD stands for gas chromatography-electron capture detector; QuEChERS-LC-MS stands for quick-easy-cheap-effective-rugged-safe-liquid chromatography-mass spectrometry.

表1 丙烯酰胺的测定方法、检出限及回收率Table 1 Determination methods, detection limits and recovery rates of acrylamide

注：GC-EI-MS/MS表示柱前衍生-EI源串联四极杆气质联用法；HF-LPME-GC/MS表示中空纤维液相微萃取-气质联用法；IEC/MS表示离子交换层析-质谱法；LLE-GC/MS表示液液萃取-气质联用法；HPLC-MS/MS表示高效液相色谱-串联质谱法；LC-MS-MS表示液相色谱-串联质谱法；SPE disk表示固相萃取盘；UAE-DLLME-GC-MS表示微萃取-气质联用法；LC-ESI-MS-Triple Quadrupole表示液相色谱-电喷雾电离三重四级杆质谱。
Note: GC-EI-MS/MS stands for gas chromatography-tandem mass spectrometry; HF-LPME-GC/MS stands for hollow fiber liquid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometer; IEC/MS stands for ion-exchange column chromatography-mass spectrometry; LLE-GC/MS stands for liquid-liquid extraction-gas chromatography-mass spectrometer; HPLC-MS/MS stands for high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; LC-MS-MS stands for liquid chromatography-tandem mass spectrometry; SPE disk stands for solid phase extraction disk; UAE-DLLME-GC-MS stands for dispersive liquid-liquid microextraction-gas chromatography-mass spectrometer; LC-ESI-MS-Triple Quadrupole stands for liquid chromatography-electron spray ionization mass spectrometry-Triple Quadrupole.

表2 丙烯酰胺对不同类群的生物体的健康危害Table 2 Health hazard of acrylamide on different taxa of organisms

2.2 生殖毒性

丙烯酰胺的生殖毒性机制类似于其神经毒性，尤其是雄性生殖系统的形态和功能受丙烯酰胺的毒害更明显[4]，像精子数目减少、活力下降、畸形率增加、DNA断裂和增殖受阻等都已被不少实验所验证[59-60]，现已证明丙烯酰胺可通过干扰类固醇激素的合成来影响动物的生殖功能[61]。Yang等[45]以灌胃的方式对大鼠进行丙烯酰胺连续染毒，发现与大鼠睾丸相关的基因被调节，引起精子形态学缺陷，附睾尾部的精子浓度降低，血清睾酮水平和间质细胞活力均呈剂量依赖性下降，最终导致精子减少。从机理上分析，可能由于丙烯酰胺通过损伤睾丸间质细胞DNA，造成相关蛋白合成受阻，从而造成细胞孕酮合成功能的下降或细胞活性降低，最终导致生殖系统功能下降[62]。王振等[63]以黑腹雄蝇为研究对象，发现丙烯酰胺能使不同阶段的生殖细胞发生突变，且精母细胞受损程度最大，这些生殖毒性必然会影响生物种群的繁衍，但受到毒性作用的生殖细胞是否会影响到子代，尚未见相关报道，同时也需作进一步研究以确定丙烯酰胺对人类的生殖危害。

2.3 遗传毒性

研究发现，丙烯酰胺主要通过2种途径产生遗传毒性，一是经细胞色素P450酶作用转化成环氧丙酰胺(GA)，可以在不同的系统中诱发基因位点突变[64]；二是可以作为Michael受体，与DNA中的硫醇、羟基和氨基形成加合物，导致DNA损伤[65]。Chen等[66]研究发现，长期暴露于丙烯酰胺后，G0/G1细胞周期会被阻碍，DNA发生断裂，从而致使细胞凋亡。Beland等[47]发现小鼠胚胎的纤维细胞经丙烯酰胺诱导后会产生DNA加合物，促使其发生基因突变。刘胜学等[51]的研究表明，高剂量丙烯酰胺(700 mg·L-1)会造成相关细胞中黄嘌呤、鸟嘌呤和核甘酸糖基转移酶基因发生突变。曹秀明等[48]发现丙烯酰胺可造成斑马鱼生殖腺细胞的DNA损伤，且损伤程度与丙烯酰胺的暴露剂量成正相关。这些影响将导致生物种群发生改变，从而引起严重的生态灾害。

2.4 致癌性

近年来，丙烯酰胺毒性的相关调查与实验，如体外试验、动物试验和流行病学调查等均显示丙烯酰胺不仅能够伤害机体的神经、生殖和遗传系统[67]，而且还具有潜在的致癌性[68-69]。早在1994年，丙烯酰胺就被IARC划分为2A类致癌物，即人类可能致癌物[13]。研究表明，不同的接触途径均可提高小鼠大脑和中枢神经系统、甲状腺、卵巢、乳腺、皮肤、肠道和肺等的致癌率[70-73]。Rudén等[74]总结了1976—2002年间14个课题组对丙烯酰胺致癌性研究的结论，最终发现，只有少数(3个)坚持“丙烯酰胺对动物和人类都不是致癌物”的观点，其余大多数(11个)都持“对动物是致癌物，对人类是可能致癌物”的结论。需要注意的是，自从开展丙烯酰胺的毒理学研究到现在，虽然丙烯酰胺对动物的致癌性已确认无疑，但其对人类是否真的具有致癌性仍有待进一步的研究，二者之间的关联并没有被明确证实[75]。

2.5 其他方面

除以上毒性，丙烯酰胺还可产生免疫损伤、氧化损伤和发育损伤。曹秀明等[48]发现丙烯酰胺对斑马鱼的肝脏、脑组织、心脏和腮等器官均具有毒性。小鼠的实验也表明，丙烯酰胺可以引起小鼠肝、肾和脾等组织的病理学变化[76-77]。赖怡等[78]从分子水平探讨了丙烯酰胺对大鼠肝脏毒性的机理，结果发现，丙烯酰胺可能通过DNA甲基化以及细胞增殖等非遗传毒性机制对肝脏产生影响。在丙烯酰胺暴露下，大鼠的超氧化物歧化酶(SOD)活性有明显的降低趋势，导致生物体内活性氧(ROS)大量堆积而得不到清除，造成脂质过氧化和蛋白降解[79-81]，进一步导致细胞的损伤，且发育毒性也是其主要毒性之一[82]。此外，有研究表明，丙烯酰胺会对海洋硅藻中肋骨条藻(S.costatum)造成明显的损伤，72 h半效应质量浓度(EC50)为90 mg·L-1[2]。由此可见，丙烯酰胺超过一定浓度时对水生生物及水生态系统会产生显著影响。水环境是与人类生存息息相关的重要载体之一，为保护人类生存和水体生态系统的稳定性，有必要开展丙烯酰胺对水生生物的毒理学研究。

3 结论与展望(Conclusions and outlooks)

通过对丙烯酰胺研究现状的分析，可以得出：(1)从污染来源来看，随着近代合成化学工业的飞速发展，越来越多的丙烯酰胺类化学品随着工业废水与生活污水未经处理被直接排放，其在环境中的迁移转化难以控制，污染遍及全球的各个角落。虽然短时间内在环境中的含量甚微，但随着生产和生活的发展，其排放量在进一步增加，必然会对生态环境构成潜在的威胁。(2)在检测方面，目前的研究主要集中在食品和淡水环境，对海洋环境的研究几乎没有涉及。丙烯酰胺被广泛应用于实际生产和生活中，很难避免输入到海洋中，而占全球总面积71%的海洋对人类所起的作用举足轻重。丙烯酰胺在海水中的稳定性如何，浓度如何，如何进行测定，目前仍不得而知。海洋与人类的生存环境息息相关，因此，加强对海水中丙烯酰胺的跟踪监测势在必行。(3)从环境危害来看，大量研究已证明丙烯酰胺会通过各种方式引起实验动物的神经毒性、生殖毒性、遗传毒性和发育毒性及潜在的致癌性，但目前对丙烯酰胺毒性的研究主要集中在虫、鼠和鱼等实验动物，对于水体中敏感性更强的浮游生物的研究几乎空白。鉴于此，在以后的研究中，可在以下几个方面开展工作：

(1)加强丙烯酰胺的管理和治理工作，采取有效的抑制排放措施和污水处理手段，尽可能减少丙烯酰胺向环境中的排放，保护生态环境和人类健康。

(2)更加深入地开展丙烯酰胺对生物体的毒性效应及作用机理的研究工作，并判断其对人类是否具有致癌性，建立一套科学的人类健康风险评价模型。

(3)加强检测水生生态环境中的丙烯酰胺污染状况，监测我国不同环境中丙烯酰胺的含量及分布情况，填补我国在此领域的数据空白。

(4)建立一种方便快捷的生物测试系统来评估水体(尤其是海洋环境)中丙烯酰胺的毒性风险。水体浮游植物个体小、生长周期短、对多种毒物敏感并可直接在细胞水平上观察，可作为测试对象应用于水生生态系统中的毒物评估。