食品中砷和硒生物可给性研究及健康风险/有益性评价

廖文，汪光，李开明，陈中颖

1. 生态环境部华南环境科学研究所，国家环境保护水环境模拟与污染控制重点实验室，广州 510655 2. 广东省水与大气污染防治重点实验室，广州 510655 3. 中国科学院广州地球化学研究所，广州 510640

硒(Se)是人体必需的微量元素。研究表明，大米和海鲜类是人体从食品中摄取硒的主要来源[1-2]。然而随着工业现代化、农村城镇化和养殖业集约化的发展，人们向环境中排放各种废水、废气和废渣，导致环境污染日趋严重。作为食物链最顶端的人类，在从食品中摄取营养的同时，也暴露在污染物的风险中。食品中的有害或有利微量元素从肠道吸收后在体内被运输至目标组织，产生毒害作用或发挥健康功能[3]。砷(As)是一种类金属元素，在自然界中普遍存在，其通过污染的水体、食物和空气经食物链进入人体后，随血液流动分布于全身各组织器官，过量砷暴露或微量砷的长期暴露都会对植物、动物和人体产生毒害作用，进而引发多器官组织和功能的异常变化，导致急性或慢性砷中毒[4-6]。大米作为我国居民的主要膳食组成，其安全性与居民的健康息息相关[7]。调查显示，我国谷类作物中含砷量为70～830 μg·kg-1，某些砷污染严重的地区如湖南郴州，水稻籽粒中砷的含量高达7 500 μg·kg-1，是稻米中砷安全标准推荐值的75倍[8]。因此，大米作为食品砷暴露的主要途径，越来越受到国内外重视[9-17]。另一方面，砷能够在海产品中富集，目前不少研究显示可食性海藻(海带、紫菜等)、鱼类和贝类等海产品中砷的含量较高，长期摄入这些海产品能导致一定的健康风险，可能造成人体砷慢性中毒[18-24]。

生物有效性(bioavailability)是指被人体吸收后进入血液，然后在体内重新分布的污染物或营养物的含量与摄入总量的比例。生物有效性测定一般通过动物或人体活体实验(invivo)得到，但是实验周期长、过程难控制[25]，因此，采用体外模拟实验(invitro)代替，获得污染物最大经口生物有效性的指示，即生物可给性(bioaccessibility)。生物可给性即污染物或营养物在胃肠环境中可以溶出的比例，基于invitro方法模拟人体消化系统(主要是胃和小肠)，采用与人体生理条件一致或相接近的人工合成消化液(唾液、胃液和小肠液等)来浸提不同基质中的污染物，测定污染物溶出量，得出污染物的生物可给性[26]；该方法操作简单、实验周期短、费用低廉、实验条件易于操作、实验结果重现性较好，同时得到的生物可给性能够很好地拟合invivo方法的实验结果[27]，因此被广泛地应用。根据实验过程和消化液成分的不同有不同的invitro方法，主要包括IVG法(InVitroGastrointestinal)、SBRC法(Solubility Bioaccessibility Research Consortium Assay)、DIN法(Ruhr-Universität Bochum, Germany)、PBET法(Physiologically Based Extraction Test)和SHIME法(Simulator of Human Intestinal Microbial Ecosystems of Infants)等[28]。其中，生理原理提取法PBET法是基于生理提取来获得生物可给性的方法，能较好地模拟实际胃肠消化，且步骤简单，与invivo得到的土壤和食品中砷、铅和其他微量元素的生物有效数据拟合性较为理想[29]。近年来关于食品中砷的生物可给性方面已有一定的研究基础[3-4,18,25-32]。但是研究所获得的结果不一，例如食品中砷的生物可给性为36%～99%，这可能与食品基质以及采用的研究方法不同有关[28]。而关于硒的生物可给性虽有研究，但主要集中在海鲜的研究[33-34]，关于大米的研究仍然较少。目前的研究结果表明，鱼肉中硒的生物可给性为50%～83%[33-34]。

本研究对广州市场上采集的大米和鱼肉进行处理后测定砷和硒的浓度，并采用PBET方法模拟胃肠消化后，分析总砷和总硒的生物可给性，最后在此基础上对食品中砷和硒的健康有益性/风险进行评价，对比初始浓度和生物可给浓度下的健康有益性/风险以及砷的致癌风险，以期为更为准确评估砷及硒的健康风险提供科学依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 样品采集

在广州市场采集大米样品共26种，其中，广东省11种、江西省3种、东北地区6种、四川省3种和广西壮族自治区3种。采集后的大米样品自然晾干，用粉碎机粉碎，过60目筛，装袋密封储存于干燥器中备用。测定总砷和总硒浓度后选取其中3个浓度梯度的大米进行生物可给性实验。

在广州某2个海鲜市场及超市采集鲚鱼(广州南沙，人工养殖)、老虎斑(珠海，人工养殖)和多宝鱼(珠海，人工养殖)。采集的鱼样品去皮、骨头等，清水洗后用超纯水冲洗3次，然后绞碎肌肉，于-20 ℃下预冷冻12 h后，一部分放入真空冷冻干燥机(ALPHA 1-2，CHRIST，德国)内冷冻干燥72 h，获得冻干样品，另一部分在-80 ℃下保存。

1.2 样品测定[35]

准确称取粉碎后的大米样品0.4 g或取鱼肉样品(未冻干样品0.5 g；冻干样品0.2 g)，加入4 mL硝酸静置直至样品基本溶于硝酸中(4～6 h)，然后加入1 mL双氧水，之后使用微波消解仪(Mars6，CEM，美国)在最大功率1 600 W条件下进行梯度消解40 min(各消解温度下的爬升时间和停留时间分别为120 ℃：6 min，5 min；150 ℃：5 min，5 min；180 ℃：4 min，15 min)。消解液定容至50 mL，采用0.22 μm水系膜过滤后待测。标准物质与空白采用同样方式消解，每个平行3份样品。

实验中砷和硒浓度采用ICP-MS(ICP-MS 7700，Agilent，美国)测定。ICP-MS的工作参数如表1所示。采用碰撞反应池模式，通入氦气(5 mL·min-1)消除40Ar35Cl的干扰。实验采用5%硝酸逐级稀释砷和硒混合标准液，由于食品中砷和硒的浓度很低，砷和硒标准曲线的浓度梯度分别为0.0、10.0、20.0、50.0和100.0 μg·L-1。选用72Ge作为内标(10 μg·L-1)，在线加入。实验测得砷和硒标准曲线相关系数均在0.9999以上。测定空白样(5%硝酸)，计算11次测定值的3倍标准偏差所对应的分析物的浓度值，即为检出限[36]，本研究中计算得到的砷和硒检出限分别为0.093和0.0022 μg·L-1。

采用大米标准物质(GBW10043)、狗鲨鱼肉(NRC DORM-2)和鱼蛋白(NRC DORM-4)标准物质(均购自中国国家标准物质研究中心，北京)用于保证方法的准确性，总量测定实验中，标准物质与其他样品在相同条件下萃取其中的砷和硒，标准物质的测定值与标准物质中砷和硒的标准含量的比值可得出方法的回收率，分别为82%～115%和91%～107%。

1.3 in vitro生物可给性实验

食品中砷和硒的生物可给性实验基于体外模拟胃-肠两阶段消化(PBET)[25]，实验中所用到的化学物质，除特别说明，均来自Sigma-Aldrich公司，为分析纯及以上。实验用水为超纯水(Milli-Q Element，Millipore，美国，电阻率≥18.2 mΩ·cm)，所用到的器皿均采用20%硝酸浸泡24 h后洗净待用。

每个反应罐中加入500 mL模拟胃液(1 L超纯水+1.25 g胃蛋白酶+0.5 g柠檬酸钠+0.5 g苹果酸+420 μL乳酸+500 μL乙酸，并用12 mol·L-1的HCl调节pH值至2)，取5 g大米或鱼肉冻干样品，通氩气1～2 min，开始计时，在37 ℃的溶出试验仪中以150 r·min-1旋涡震荡1 h；旋转条件下取30 mL消化液。在进入肠阶段前，先用饱和NaHCO3溶液将pH值调至5.3，然后在每个反应罐中加入0.875 g胆酸钠(m(食物样品)∶m(胆酸钠)=1∶0.175)和0.25 g胰酶(m(食物样品)：m(胰酶)=1∶0.05)；再用1 mol·L-1的NaOH将pH值调至7.0；在37 ℃的溶出试验仪中以150 r·min-1旋涡震荡2 h；旋转条件下取30 mL消化液。消化液在5 000×g离心15 min，上清液采用0.22 μm水系膜过滤后，采用ICP-MS测定砷和硒。

表1 ICP-MS仪器的工作参数Table 1 ICP-MS instrument parameters

1.4 生物可给性及健康风险计算

根据样品测定结果，食品中砷和硒的生物可给性可按照以下公式计算[24]：

(1)

为了评价鱼肉中砷和硒的健康有益性/风险及砷的致癌风险，采用每日摄入量(EDI)及目标癌症风险(TR)[37-38]：

(2)

(3)

式中：DC为每日大米或鱼肉摄入量(g·d-1)；Ci为大米或鱼肉中的砷或硒浓度或者生物可给浓度(μg·g-1)；BW为人的体重(成人60 kg，小孩32.5 kg)[39]。小孩和成人大米摄入量分别为277和389 g·d-1，广东省成人鱼肉摄入量为60 g·d-1，小孩鱼肉摄入量为41 g·d-1[39]。EF为暴露频率(365 d·a-1)，ET是暴露时间(70 a)，AT为平均暴露天数(25 550 d)，CSF为癌症斜率系数(1.5 (mg·kg-1·d-1)-1)，可接受或可容忍的风险为10-4[38]。

1.5 统计分析

采用SPSS 21.0和OriginLab 9.0分析数据。采用单向方差分析显著性，当P<0.05，则认为具有显著性。所有的数据采用平均值或者平均值±标准偏差的形式。所有质量浓度均为干重形式。

2 结果与讨论(Results and discussion)

2.1 食品中砷的含量和生物可给性

选取的3种大米中砷的平均浓度为0.085、0.121和0.168 μg·g-1。Zhuang等[9]在华南地区采集3种不同品牌大米进行风险评价，市场售卖的大米中砷的浓度为0.086～0.156 μg·g-1，与本研究大米中砷的浓度相似。绿色食品大米标准(NY/T418—2000)中规定砷浓度≤0.40 μg·g-1，从已有样品的砷含量来看，广州市场大米总砷含量均满足绿色食品大米标准。

鱼肉中砷的含量较高，鲚鱼(大)、老虎斑和多宝鱼中砷的平均浓度分别为2.224、4.649和5.533 μg·g-1，根据含水率核算得到湿重下3种鱼肉中砷的平均浓度分别为0.433、1.100和1.030 μg·g-1。Zhang等[22]对深圳某海水养殖区的河豚和石斑鱼进行检测，其中肌肉组织中砷的含量(干重)分别为1.04～1.86和2.59～7.85 μg·g-1，与本研究中的多宝鱼和老虎斑的结果类似。

来自同一海域的不同的鱼体中砷的浓度不一，这可能与不同鱼类代谢的方式和程度以及不同栖息和摄食习性等有关。已有研究表明，海水鱼中重金属的平均浓度大于淡水鱼[40]，肉食性鱼中重金属的含量大于杂食性和草食性鱼[41]。老虎斑是典型的肉食性海鱼类，主要摄食鱼、虾、蟹和章鱼等海洋生物；多宝鱼摄食甲壳类、小鱼和虾等；鲚鱼属河口性洄游鱼类。因此，湿重形式下老虎斑浓度最大。

由图1可知，大米中的砷生物可给性为86.86%～99.34%，而鱼肉中砷的生物可给性相对来说较低，为51.95%～75.64%。大米和鱼肉中砷的生物可给性相异的原因可能在于砷在不同食品中分布的形态不一样。研究表明，当食品中无机砷的生物可给性远远高于其他形态的砷[30]。Huang等[42]曾报道，无机砷为我国大米中砷的主要形态，占比约为78.3%左右。而水产品(如鱼肉)中砷的主要形态为砷甜菜碱，同时有部分的二甲基砷酸盐[21]。

2.2 食品中硒的含量和生物可给性

大米和鱼肉中硒的含量列于表2中。3种大米中硒的含量为0.098～0.190 μg·g-1，高于Chen等[1]的研究中广东省售卖的大米中硒的平均含量，为(0.0039±0.0018) μg·g-1。而鱼肉中硒的含量为1.641～2.315 μg·g-1干重，与其他文献中关于鱼肉硒含量的报道相似[2]。由图2可知，大米中硒的生物可给性为76.73%～85.44%，而鱼肉中硒的生物可给性为71.48%～79.83%。食品中硒的生物可给性也与其化学形态有关。食品中，在大米中硒的主要形态为硒代蛋氨酸(SeMet)，而在鱼肉中硒的主要形态为硒代半胱氨酸(SeCys2)[2,43]。Khanam和Platel[34]曾报道，SeMet的生物可给性要大于SeCys2。因此，大米中硒的生物可给性大于鱼肉样品中硒的生物可给性。

对比砷和硒胃生物可给性和胃肠生物可给性的数据发现，相较于胃消化，完成模拟胃肠阶段消化后，食品中砷和硒的生物可给性均有所上升(图1和图2)。这是因为，在酸性条件下(pH=2.0)，胃蛋白酶接受更多的氢离子使其更好地打破肽键，将蛋白质水解。而在肠消化阶段，pH调至pH=5.3～7.0，胰液中的酶催化多糖被水解形成单糖，并进一步破坏蛋白质的结构，形成自由氨基酸和缩氨酸，促进了结合在蛋白质上砷和硒的释放，另一方面胆盐能增强胰酶的活性。因而在胃肠消化后，砷和硒的生物可给部分更多得以释放出来[25]。

图1 大米、鱼肉中砷的胃生物可给性、胃肠生物可给性Fig. 1 Gastric and gastrointestinal bioaccessibility of arsenic in rice and fish

图2 大米、鱼肉中硒的胃生物可给性、胃肠生物可给性Fig. 2 Gastric and gastrointestinal bioaccessibility of selenium in rice and fish

表2 大米和鱼肉中总砷和总硒的含量及生物可给浓度Table 2 Total contents and bioaccessible concentration of arsenic and selenium in rice and fish

表3 大米和鱼肉中砷和硒的每日摄入量(EDI)Table 3 Estimated daily intake (EDI) of arsenic and selenium in rice and fish

2.3 健康有益性/风险评价

所研究的大米和鱼肉中总砷和总硒的每日摄入量如表3所示。

以生物可给的浓度计算得到的每日砷和硒摄入量均小于以食品中砷和硒的初始浓度计算得到的值。计算得到每日通过大米和鱼肉摄入的硒为0.274～1.025 μg·kg-1，硒在微量情况下对人体有利，其推荐摄入量为最高为55 μg·d-1(即成人和小孩分别为1.69和0.92 μg·kg-1·d-1)[1]，因此，仍需通过膳食调整，使从大米和鱼肉摄入的硒来满足人体需求，尤其对于小孩来说，应该注意硒的适量摄入。大米中无机砷含量约占45%～78.3%[16]，而鱼肉中无机砷含量约占总含量的5%[38]，通过公式(2)和(3)，计算得到成人和小孩通过表3中摄入无机砷的致癌风险分别为1.69×10-5～5.81×10-4和2.13×10-4～7.34×10-4，是可接受或可容忍的风险的0.17～7.3倍。因此，尽管通过大米和3种鱼摄入的无机砷占国际粮农组织和世界卫生组织(FAO/WHO)公布的无机砷的每周暂定耐受量(PTWI)[6](15 μg·kg-1BW，折算成每日最高暂定耐受量为2.1 μg·kg-1BW)的0.5%～35.7%，但是所研究的大米和鱼肉中无机砷的致癌风险较大，尤其是小孩，更易摄入砷产生毒害。

针对广州市售的大米和鱼肉中砷和硒的生物可给性进行了研究，结果表明，大米和鱼肉中86.86%～99.34%和51.95%～75.64%的砷生物可给，76.73%～85.44%和71.48%～79.83%的硒生物可给。并在生物可给浓度的基础上对每日摄入量进行了计算。在广州，成人和小孩每日通过大米和鱼肉摄入的硒为0.274～1.025 μg·kg-1，摄入的砷为0.225～1.017 μg·kg-1，但计算得到成人和小孩摄入无机砷的致癌风险是可接受或可容忍的风险的0.17～7.3倍，日常生活中需要注意减少砷含量较高的海鱼以及无机砷较高的大米的摄入，尤其是小孩。但本文只单独考察了总砷的摄入，无机砷的百分含量是根据文献估算，下一步应考察无机砷的生物可给性，综合其他食品中砷的生物可给性以及通过水、土壤等环境介质摄入的砷进行人体砷暴露风险评价。