喹啉高效降解菌株Alcaligenes sp. WUST-qu的筛选、鉴定及降解特性

刘建忠，易红磊，翟 赟，黄 皓，陈 俊，周 卫，秦晓蓉

(武汉科技大学 化学与化工学院,武汉 430081)

喹啉及其衍生物是一类重要的工业原材料和溶剂，广泛存在于煤焦油、页岩、石油等物质中[1-2]，用途包括医药、染料、油漆、木材加工等行业。喹啉在医药上主要用于制造烟酸系、8-羟基喹啉系和奎宁系三大类药物，其中的代表之一就是为众人所熟知的、全球广泛使用的抗疟疾特效药奎宁。与之同时，喹啉及其衍生物又是一类典型的环境污染物，具有难降解、有毒、致畸甚至致癌的作用。研究表明，4-硝基喹啉-1-氧化物不仅会对小麦和蚕豆的发芽率、出苗率和苗高有明显的抑制作用，而且会诱发其根尖细胞染色体发生畸变[3-4]，该物质还能诱发大鼠舌黏膜发生癌变[5]。

微生物生物技术用于环境污染的治理具有生态友好和经济有效等特点，已成为现代工业可持续发展的重要技术保障之一。筛选能高效降解一种或几种特定有机污染物的菌株，并添加到活性污泥中以实现对特定污染物高效降解的生物强化作用具有重要意义[1-2,6]。本研究从武汉某焦化厂污水处理系统曝气池的活性污泥中筛选到一株喹啉高效降解菌，并对该菌株进行形态学、分类地位、降解特性和生长动力学研究。

1 材料与方法

1.1 活性污泥的采集

用于分离目标菌株的活性污泥采集自武汉某焦化厂污水处理系统曝气池，具体做法为采用长柄勺舀曝气池面上0～20 cm处的活性污泥，盛入事先准备好的塑料桶，带回实验室用于后续处理。

1.2 培养基

培养基包括LB液体培养基，无机盐培养基(Mineral salt medium,MSM)，MSM固体/斜面培养基，微量元素培养液等，其各自的成分和配制参照文献[7]完成，经高压灭菌后待用。

1.3 菌种的富集、驯化和分离

采用文献[8]介绍的筛选苯酚降解菌的方法完成菌种的富集、驯化和分离。

1.4 菌株的革兰氏和芽孢染色

参照文献[7]完成。

1.5 扫描电镜样品的制备及观察

用于扫描电镜观察的样品经戊二醛(2.5%)固定、磷酸盐缓冲溶液洗涤(3次，每次5 min)、体积分数依次增加的乙醇脱水 (20%，50%，70%，85%，95%，100%；每体积分数下脱水10 min)、叔丁醇置换2～3次(φ=100%，每次10 min)、真空干燥40～60 min，喷金观察。扫描电镜为Nova 400 NanoSEM，FEI(美国)，工作电压为15 kV。

1.6 菌株16S rRNA基因部分核苷酸序列的测定及系统发育树的构建

菌株16S rRNA基因部分核苷酸序列由武汉擎科创新生物技术有限公司测定。扩增所使用的引物的核苷酸序列为：27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) 和1492R (5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT -3′)，扩增产物的大小约为1 400 bp。使用BLAST程序对美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中的16S rRNA基因核苷酸序列进行搜索，并使用“分子进化遗传分析(MEGA 5.0)”软件分析序列，应用ClustalW算法进行逐对和多重序列比对，利用邻接法(Neighbour-joining method)构建系统发育树。

1.7 菌体生物量、喹啉和苯酚质量浓度的测定

菌体生物量是采用分光光度计(UV-2000，日本)测定培养液于600 nm处的吸光值，并通过事先建立的菌体干质量与OD600的校正曲线进行计算；喹啉的测定方法是比色法，参比为不含喹啉的MSM，测定波长为277 nm；苯酚的测定采用4-氨基安替吡啉法，参比为不含苯酚的MSM，测定波长为510 nm。

1.8 种子液的制备

在500 mL三角瓶中，加入质量浓度为500 mg·L-1的喹啉/苯酚的MSM 200 mL，接入1 mL 菌株WUST-qu培养液，在中性pH和37 ℃、150 r·min-1培养条件下培养，直到对数生长晚期。将培养液转入50 mL离心管，以 8 000 r·min-1的转速离心5 min以回收菌体，用20 mL MSM重新悬浮沉淀，以相同的条件离心回收菌体，重复2次。以适量MSM重悬沉淀，并将悬液的OD600调整至1.0，以之为降解试验中的种子液，接种量为培养液总体积的5%。

1.9 菌体生长动力学

测定每个喹啉质量浓度下不同时间的生物质质量浓度，通过对指数生长期的生物质质量浓度与培养时间的半对数作图做线性最小二乘回归(Linear least-square regression)，拟合出菌体的比生长速率；采用软件 Origin 8.0，将菌株的比生长速率与对应的底物质量浓度进行非线性最小二乘拟合得到Haldane方程中的各参数。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离及鉴定

经过连续的富集、驯化和梯度稀释涂布添加500 mg·L-1喹啉的MSM琼脂平板，获得55个单菌落，经在添加相同质量浓度喹啉的MSM琼脂平板上划线纯化后，将每一菌落分别于MSM斜面培养基和添加φ=20%甘油的MSM中于-80 ℃保存。之后对获得的所有菌落逐一进行以喹啉为唯一碳源的摇瓶培养试验。结果表明，编号为Qu-12的菌株显示突出的喹啉降解能力，将其命名为WUST-qu，并用于后续的研究。该菌株革兰氏、芽孢染色结果如图1和图2所示，扫描电镜放大20 000倍和50 000倍的结果如图3所示。

图1 菌株WUST-qu革兰氏染色结果Fig.1 The Gram stain of the bacterial strain WUST-qu

图2 菌株WUST-qu芽孢染色结果Fig.2 The spore stain of the bacterial strain WUST-qu

图3 菌株WUST-qu的扫描电镜图(A.20 000倍,B.50 000倍)Fig.3 The scanning electron microscope image of bacterial strain WUST-qu (A.20 000×; B.50 000×)

由图1可见，菌株经革兰氏染色后呈粉红色，表明该菌株为革兰氏阴性菌；由图2可见，菌株经芽孢染色后呈绿色，表明该菌株产芽孢。由图3可见，该菌株呈典型的杆状菌的特征，长为1.15 μm±0.08 μm，宽为0.26 μm±0.01 μm，无可见的鞭毛。菌株WUST-qu 16S rRNA基因部分核苷酸序列 (1 435 bp)已提交到GenBank，登录号为MF099860。核苷酸序列比对结果表明，该菌株16S rRNA基因与产碱杆菌属菌株M14和JASI的同源性均高达99%，故将该菌株鉴定为产碱杆菌属(Alcaligenesfaecalis)，采用邻接法构建的系统发育树如图4所示。

图4 基于16S rRNA基因核苷酸序列同源性构建的菌株WUST-qu系统发育树Fig.4 The phylogenetic tree of bacterial strain WUST-qu based on the nucleotide homology of its 16S rRNA gene

2.2 菌株WUST-qu在不同初始pH降解喹啉的特征

环境pH是影响受污染地点生物修复效果的重要因素之一，因而测定菌株WUST-qu在不同初始pH降解喹啉的降解特征。菌株WUST-qu于MSM初始pH为5.0～9.0时降解不同初始质量浓度喹啉的特征以及在降解过程中生物质增长的特征如图5所示。

由图5可见，MSM初始pH为5.0时，菌株WUST-qu能在24、30、36和60 h之内分别将初始质量浓度为100、200、300和400 mg·L-1的喹啉完全降解，在降解不同初始质量浓度的喹啉时均呈现出明显的生长延滞期(12～30 h)，延滞期有随喹啉初始质量浓度提高而延长的趋势；与MSM初始pH为5.0相比，MSM初始pH为6.0时，酸性环境对菌株WUST-qu所产生的胁迫作用明显减弱，菌株降解喹啉的活力得到明显提升。能够完全降解喹啉的最高质量浓度由之前的400 mg·L-1提升到600 mg·L-1，完全降解低质量浓度喹啉所需要的时间明显缩短，延滞期也有所缩短，但对于初始质量浓度为600 mg·L-1的喹啉，菌株依旧呈现出较长的生长延滞期(30 h)；中性pH明显有利于菌株WUST-qu对喹啉的降解，能够在接种后48 h内将初始质量浓度为700 mg·L-1的喹啉完全降解，700 mg·L-1是该菌株能够完全降解喹啉的最高质量浓度，菌体生长的延滞期较之pH 5.0和6.0时大为缩短；菌株WUST-qu在MSM初始pH为8.0时降解不同初始质量浓度喹啉和在降解过程中生物质的变化特征与MSM初始pH为7.0时如出一辙，不再赘述。这在很大程度上表明，中性或者略偏碱性(7.0～8.0)是该菌株降解喹啉的理想pH范围；MSM初始pH为9.0时，菌株WUST-qu降解初始质量浓度为600 mg·L-1以下的喹啉都尚属顺畅，只是完全降解初始质量浓度为600 mg·L-1的喹啉所需的时间较初始pH为7.0时延长6 h，而完全降解初始质量浓度为700 mg·L-1的喹啉所需的时间则大幅度延长24 h之多。菌体生物质增长特征与初始pH为7.0时相比，差异很小，最明显的差异莫过于初始喹啉质量浓度为700 mg·L-1的试验组的延滞期延长30 h之多，但一旦越过延滞期之后，菌体生物质呈指数增长，与之相伴随的是喹啉被快速降解。

图5 菌株WUST-qu在MSM初始pH为5.0～9.0、降解不同初始质量浓度喹啉时的降解曲线和生物量的增长曲线Fig.5 The biodegradation and biomass growth curves of bacterial strain WUST-qu degrading quinoline at different initial mass concentrations at initial pH of between 5.0-9.0

2.3 菌株WUST-qu降解苯酚的特征

关于菌株WUST-qu底物广谱性的研究表明，该菌株不仅能够有效降解喹啉，还能有效降解苯酚。菌株于MSM初始pH为8.0，于35 ℃和150 r·min-1的旋转摇床上培养时，降解不同初始质量浓度苯酚以及在降解过程中生物质的增长特征如图6所示。

由图6可见，菌株WUST-qu能够在8、20、24和32 h之内分别将初始质量浓度为100、300、500和700 mg·L-1的苯酚完全降解，但即便是降解初始质量浓度仅为100 mg·L-1的苯酚，菌株WUST-qu也显示出4 h的延滞期，而且随着苯酚初始质量浓度的提高，延滞期逐渐延长。

2.4 菌株WUST-qu以喹啉为唯一碳源时的生长动力学

菌株比生长速率与喹啉初始质量浓度的关系如图7所示。

图6 MSM初始pH为8.0时菌株WUST-qu降解不同初始质量浓度苯酚时的降解曲线和生物量的增长曲线Fig.6 The biodegradation and biomass growth curves of bacterial strain WUST-qu degrading phenol at different initial mass concentrations at initial pH of 8.0

从图7可见，比生长速率先是随着喹啉初始质量浓度的提高而增加，到达某一质量浓度后(即到达Sm值后)， 随喹啉质量浓度的升高而降低，最大比生长速率对应的喹啉质量浓度为55.545 mg·L-1。其他参数如下：μmax= 1.657 6 h-1，Ks= 36.42 mg·L-1，Ki= 81.418 mg·L-1，R2= 0.968。

3 讨 论

本研究报道的菌株WUST-qu能够完全降解喹啉的最高质量浓度为700 mg·L-1，虽不及郑中原等[9]和Sun等[2]的结果，但高于绝大多数公开报道的结果[1,10-11]。这些较低的数值与喹啉在水中的溶解性较差有关，也充分反映出喹啉的难降解性；与其同属含氮杂环化合物的吡啶，能与水以任意比例互溶，文献[12]报道的微生物能够完全降价吡啶的浓度高达70 mmol·L-1(质量浓度5 537 mg·L-1)。关于微生物降解喹啉的机理，已有很多有益的探索。不同种属的微生物降解喹啉的途径可能不尽相同，但大的方面是一致的。概括的途径是喹啉经两次羟基化，产物分别为2-羟基喹啉和2,8-二羟基喹啉，后者被转化为8-羟基香豆素和3-(2,3-二羟基苯基)丙酸，并进一步被矿化为CO2和H2O。在本研究中，也采用GS/MS对代谢产物进行监测，检测到2-羟基喹啉的存在，但没有检测到其他代谢中间产物。

图7 菌株比生长速率与喹啉初始质量浓度的关系Fig.7 The relationship between the specific growth rates of the bacterial strain and the initial mass concentrations of quinoline

尽管菌株WUST-qu也能有效降解苯酚，但其降解效率却不及笔者之前筛选到的以降解苯酚为目标的菌株Pseudomonassp. WUST-C1[8]，后者能在接种后4 h和32 h内将初始质量浓度分别为200 mg·L-1和为1 200 mg·L-1的苯酚完全降解，而且在降解较低质量浓度的苯酚(< 400 mg·L-1)时不表现出延滞期。有研究表明[13]，在有氧条件下，微生物降解苯酚的第一步是在羟化酶的作用下，将苯酚转化为邻苯二酚，随后，邻苯二酚通过邻位或间位裂解途径开环。而喹啉微生物降解的起始也包含两步连续的羟基化，并进而转化为2,8-二羟基喹啉。这种代谢途径上的相似性是解释菌株WUST-qu既能有效降解喹啉又能有效降解苯酚可能的机理之一。

生长动力学知识对于了解微生物降解喹啉的能力是极其重要的。Haldane动力学方程常用于描述抑制性底物在纯培养或混合培养时的细胞生长速率。为了获得菌体生长的动力学模型参数，测定喹啉初始质量浓度为50～700 mg·L-1时不同时间的生物质质量浓度，通过线性最小二乘回归拟合出菌体的比生长速率，通过非线性最小二乘拟合得出Haldane方程中的μmax、Ks和Ki值。Zhu等[10]采用Haldane模型研究一株红球菌属菌株QL2以喹啉为底物生长时的动力学，获得的相关参数分别为：μmax= 0.499 h-1，Ks= 68.7 mg·L-1，Ki= 387.1 mg·L-1；李静等[14]报道一株嗜酸菌属菌株降解喹啉的Haldane动力学参数：μmax= 0.640 h-1，Ks= 164 mg·L-1，Ki= 253 mg·L-1。本研究中的菌株WUST-qu的最大比生长速率远高于Zhu等[10]和李静等[14]报道的结果，这意味着WUST-qu可以在含高质量浓度喹啉的工业废水中快速生长，并因此迅速降解喹啉，显示出在应对喹啉污染突发事件中较大的应用潜力。