基于PLO基因的山羊化脓隐秘杆菌PCR检测方法的建立与应用

沈克飞，杨 柳，付利芝，徐登峰，许国洋，张素辉

(1.重庆市畜牧科学院，重庆 402460; 2.重庆市兽用生物制品工程技术研究中心，重庆 402460)

化脓隐秘杆菌(Trueperellapyogenes)是革兰氏阳性短棒状杆菌，是牛、羊和猪等重要经济动物的条件性致病菌，常寄生于上呼吸道和消化道黏膜，可引起多种器官和黏膜发生化脓性感染，多数情况下感染造成慢性消耗性疾病[1-4]。从白尾鹿[5]、狍[6]脑脓肿中也分离到致病性化脓隐秘杆菌。该菌常与其他病原菌混合感染[7]。这些病原菌致病性及耐药性存在差异，给疫病防治带来困难。急需解决的问题是如何进行化脓性感染病原体的快速鉴别，这对疾病防治有重要意义。

化脓隐秘杆菌不易培养且生长缓慢，传统病原菌分离鉴定方法费时，且易出现漏检，不能达到快速诊断的目的。现有的化脓隐秘杆菌快速鉴别方法是分子检测方法，主要靶基因是PLO(Pyolysin)基因[8]。重庆市畜牧科学院兽医兽药研究所(本所)在检测山羊化脓性样本过程中发现，基于化脓隐秘杆菌PLO基因建立的PCR检测方法最易与伪结核棒状杆菌发生交叉反应。为此，本研究基于PLO基因建立常规PCR检测方法，并进行特异性和敏感性评价，为化脓隐秘杆菌的快速鉴别提供一种可靠方法。

1 材料与方法

1.1 菌株及样品

化脓隐秘杆菌、伪结核棒状杆菌、葡萄球菌、奇异变形杆菌、类芽孢杆菌、酿脓链球菌、明串球菌、肠球菌、大肠杆菌、肠球菌、溶血性曼氏杆菌、沙门氏菌等均由本所分离、鉴定及保存。化脓隐秘杆菌感染的小鼠肺脏组织、淋巴结组织、脓液由本所攻毒、鉴定及保存。

1.2 试 剂

TSB或TSA培养基购自BD；PCR Mix、细菌DNA提取试剂盒、组织DNA提取试剂盒购自TaKaRa。

1.3 序列分析及引物设计

将化脓隐秘杆菌重庆分离株2012CQ-ZSH基因组(GenBank登录号CP012649)中的PLO基因及其蛋白质序列在NCBI上进行BLAST搜索，以进行同源性分析。根据此序列采用Primer-BLAST方法搜索引物，从候选引物中筛选4对，由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列见表1。

1.4 DNA模板的制备

用TSB或TSA培养化脓隐秘杆菌，收获培养物，使用细菌DNA提取试剂盒提取细菌DNA。取小鼠肺脏组织、淋巴结组织、脓液样本，使用组织DNA提取试剂盒提取DNA。

1.5 PCR扩增

将上述提取的DNA模板用上述引物进行PCR扩增，阴性对照为超纯水，PCR反应体系为20 μL，反应体系见表2。PCR反应参数为：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，30个循环；72 ℃ 3 min；室温保存。

表1 引物信息Table 1 Primer Information

表2 PCR反应体系Table 2 PCR reaction system

1.6 特异性分析

培养伪结核棒状杆菌、葡萄球菌、奇异变形杆菌、类芽孢杆菌、酿脓链球菌、明串球菌、肠球菌、大肠杆菌、肠球菌、溶血性曼氏杆菌、沙门氏菌等细菌。使用细菌DNA提取试剂盒提取细菌DNA。以此为模板，按上述反应体系和反应参数进行PCR扩增以验证PCR方法的特异性。

1.7 敏感性分析

使用细菌DNA提取试剂盒提取新鲜培养的化脓隐秘杆菌DNA，测定核酸质量，调整质量浓度为1 000 ng/μL，依次稀释成100 ng/μL、10 ng/μL、1 ng/μL、1×10-1ng/μL、1×10-2ng/μL、1×10-3ng/μL、1×10-4ng/μL、1×10-5ng/μL和1×10-6ng/μL。以上述10个稀释度的DNA溶液为模板进行PCR扩增。同时按上述方法稀释小鼠肺脏组织、淋巴结组织、脓液样本的DNA，测试PCR方法的敏感性。

1.8 临床样本检测

使用组织DNA提取试剂盒提取临床样本，样本包括患化脓性感染疾病的山羊淋巴结(157份)、肺脏(186份)、脓液(97份)等。反应体系见表3，按“1.5”中反应参数进行PCR扩增，阴性对照为伪结核棒状杆菌DNA。

表3 化脓隐秘杆菌检测PCR反应体系Table 3 PCR reaction system of detecting T.pyogenes

1.9 PCR产物检测及结果分析

取5 μL PCR扩增产物用12 g/L琼脂糖凝胶进行电泳检测。回收阳性条带，将其克隆至pMD18-T，转化至DH5α，挑选阳性克隆对其中的插入片段进行序列测定，在NCBI进行BLST搜索以进行同源性比对。

2 结果与分析

2.1 序列分析

PLO基因在化脓隐秘杆菌不同分离株中相对保守，同源性高于96%，与其他细菌无同源性。PLO蛋白质在化脓隐秘杆菌不同分离株中的同源性高于98%，与其他细菌的同源性低于67%。所有引物与化脓隐秘杆菌核苷酸序列的覆盖率和同源性最高，均为100%；与其他细菌核苷酸序列的覆盖率低于95%。

2.2 PCR结果及其产物分析

4对引物均能从化脓隐秘杆菌培养物、确诊含有化脓隐秘杆菌的小鼠肺脏组织、淋巴结组织和脓液中特异性扩增出与预期大小相符的目的条带(图1)。序列测定和序列分析结果显示，所得序列与化脓隐秘杆菌PLO基因的同源性高于92%，与其他细菌无同源性，表明所扩增片段是化脓隐秘杆菌PLO基因。

2.3 F1/R1-PCR特异性

只有F1/R1引物对能从化脓隐秘杆菌DNA模板中扩增出特异条带，而未从伪结核棒状杆菌、葡萄球菌、奇异变形杆菌、类芽孢杆菌、酿脓链球菌、明串球菌、肠球菌、大肠杆菌、肠球菌、溶血性曼氏杆菌、沙门氏菌等细菌DNA中扩增出条带，表明F1/R1引物对能准确检测化脓隐秘杆菌，且区分其他细菌(图1)。

2.4 F1/R1-PCR敏感性

由图2可知，以化脓隐秘杆菌纯培养物DNA为模板，DNA质量浓度为1×10-3ng/μL 时能出现清晰可见的目的条带，质量浓度小于1×10-3ng/μL 时无明显条带出现。由此可见，F1/R1-PCR准确检测化脓隐秘杆菌的最低模板质量浓度为1×10-3ng/μL。以小鼠肺脏组织、淋巴结组织、脓液样本的DNA为模板，F1/R1-PCR能扩增出清晰条带的DNA质量浓度为1×10-2ng/μL。

A.F1/R1引物对 Primer pair F1/R1; B.F2/R2引物对 Primer pair F2/R2; C.F3/R3引物对 Primer pair F3/R3; D.F4/R4引物对 Primer pair F4/R4; M.DNA marker DL2000；1.化脓隐秘杆菌固体培养物T.pyogenescultured in solid medium；2.化脓隐秘杆菌液体培养物T.pyogenescultured in liquid medium；3.肺脏组织 Lung；4.淋巴结组织 Lymph gland；5.脓液 Pus；6.阳性对照 Positive control；7.伪结核棒状杆菌Corynebacteriumpseudotuberculosis；8.葡萄球菌Staphylococcus；9.奇异变形杆菌Proteusmirabilis；10.类芽孢杆菌Paenibacillus；11.酿脓链球菌Streptococcuspyogenes；12.明串球菌Leuconostocmesenteroides；13.大肠杆菌Escherichiacoli；14.肠球菌Enterococcus

图1PCR检测结果
Fig.1ResultsofPCRdetection

M.DNA marker DL2000；1.1 000 ng/μL；2.100 ng/μL；3.10 ng/μL；4.1 ng/μL；5.1×10-1ng/μL；6.1×10-2ng/μL；7.1×10-3ng/μL；8.1×10-4ng/μL；9.1×10-5ng/μL；10.1×10-6ng/μL ；11.阴性对照 Negative control

图2F1/R1-PCR敏感性分析
Fig.2F1/R1-PCRsensitivityanalysis

2.5 临床样本检测及其PCR产物分析

运用F1/R1-PCR方法能从患化脓性感染的山羊淋巴结(121份)、肺脏(174份)、脓液(83份)中扩增出与预期大小相符的目的条带。对280条临床样本中扩增所得阳性条带的序列测定和序列分析结果显示(图3)，所得序列是化脓隐秘杆菌PLO基因。结果表明所建立的PCR方法能有效地从临床待检样本中检测化脓隐秘杆菌。

M.DNA marker DL2000；1.阳性对照 Positive control；2.阴性对照 Negative control；3～7.临床样品 Clinical samples

图3临床样品的检测
Fig.3Detectionresultsofclinicalsamples

3 讨 论

化脓隐秘杆菌已有PCR、LAMP等快速检测方法[8-9]。相对于PCR方法来说，LAMP方法检测优点很明显，不需要昂贵的PCR仪、检测灵敏度高、特异性强、结果可视化等；LAMP方法检测缺点也很明显，核酸提取、试剂加取需要洁净、封闭的空间以防污染，试剂成本高，操作步骤多等。基层兽医站等机构现阶段已配备PCR仪、电泳仪等设备，但基本没有配备高洁净度的实验室或降低气溶胶产生的独立空间。因此，常规PCR方法更适合在基层推广使用。

化脓隐秘杆菌分子检测目前常用的靶基因主要有16S rRNA基因和PLO基因[8-9]。PLO基因在所有化脓隐秘杆菌分离菌中均能检测到[10-11]。相对于16S rRNA基因，PLO基因在化脓隐秘杆菌更保守，是理想的检测靶基因。但在实际应用中发现，基于PLO基因建立的PCR检测方法极易与伪结核棒状杆菌发生交叉反应，得出错误的检测结果。本所对重庆养殖场的山羊淋巴结炎等化脓性样本进行细菌分离鉴定，检出率最高的是球菌，主要是酿脓葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌等；其次是杆菌，主要有溶血性曼氏杆菌、奇异变形杆菌、化脓隐秘杆菌、伪结核棒状杆菌等。基于兽医临床和实验室病原菌分离结果，采用上述细菌作为参照建立检测化脓隐秘杆菌感染的特异性PCR检测方法，该方法无需进行病原菌分离培养，可快速、准确鉴别化脓隐秘杆菌感染，为临床治疗争取时间。