金黄色葡萄球菌定性实验的两种方法比较

吕 辉，刘 霞，龚 维，刘 新，姚旭霞

(中国兵器工业集团第五三研究所，山东济南 250031)

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是葡萄球菌属(Staphylococcus)的典型代表之一，菌体直径约为0．8μm，小球形，常堆聚成葡萄串状，革兰氏阳性，无芽孢和荚膜［1］，别称“嗜肉菌”，是人类的一种重要的病原菌［2］。它能够产生肠毒素，导致腹泻等肠道疾病，也可引起局部或者全身化脓感染［3］，严重可导致死亡。金黄色葡萄球菌广泛存在于自然界中，空气、水、土壤、灰尘甚至是人的皮肤表面都可以找到。因此，在生物、医药和食品卫生检验中，金黄色葡萄球菌的定性实验都是重要的检查项目。

在食品检测中，对于金黄色葡萄球菌的定性实验，通常采用GB 4789．10－2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》中的第一法［4］(简称 标准方法)进行检验，主要是通过验证金黄色葡萄球菌在不同平板上的菌落状态和某些生理活动产生的生化反应来判定是否有金黄色葡萄球菌的存在。随着微生物检验技术的不断发展，一些大型微生物自动鉴定仪能够通过集成某些生化反应，自动鉴定微生物的种类，使得微生物的鉴定更加高效便捷，在日常检验中的应用逐步广泛起来，因此也可以作为金黄色葡萄球菌定性检测的重要方法。

1 实验原理

1．1 标准方法

根据GB 4789．10－2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》中的第一法，采用观察菌落在不同平板上的形态和血浆凝血酶实验共同判定是否为金黄色葡萄球菌。

1．1．1 BP 平板

金黄色葡萄球菌在BP平板上，菌落为棕黑色或黑色，周围会出现透明环。这是因为金黄色葡萄球菌可以还原亚碲酸钾中的碲元素，此时颜色变为棕黑色或黑色。同时，金黄色葡萄球菌还可以产生卵磷脂酶，溶解培养基中的卵黄，从而形成透明环。

1．1．2 血琼脂平板

金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上，菌落周围会出现透明溶血环，是因为致病性的金黄色葡萄球菌能够产生溶血毒素。

1．1．3 血浆凝固酶实验

金黄色葡萄球菌能够使新鲜的兔血浆凝固，因为金黄色葡萄球菌能产生凝血浆酶，使血液凝固。

1．2 微生物自动鉴定仪法

梅里埃VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定系统是一种高度集成化的仪器，需要与微生物鉴定卡共同使用，该卡片还有多个小格，添加了不同的化学试剂，菌液通过仪器被压入卡片中，进入各个小格，与其中试剂发生生化反应，在仪器的孵育箱中孵育一定时间，仪器每隔15 min自动扫描一次，将每个小格内的颜色变化记录下来，并综合分析，鉴定出不同的菌种。

2 实验仪器与试剂

2．1 标准方法

生化培养箱，上海新苗医疗器械制造有限公司;百级超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司;立式灭菌器，山东新华医疗器械股份有限公司;血琼脂平板，北京路桥技术股份有限公司;Baird－Parker琼脂平板，北京路桥技术股份有限公司;兔血浆，北京路桥技术股份有限公司;革兰氏染色液试剂盒，北京路桥技术股份有限公司。

2．2 微生物自动鉴定仪法

VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定系统，梅里埃(上海)生物制品有限公司;4．5%生理盐水，梅里埃(上海)生物制品有限公司;电子浊度仪，梅里埃(上海)生物制品有限公司;革兰氏阳性菌鉴定卡，梅里埃(上海)生物制品有限公司。

3 实验过程

3．1 标准方法

(1)预先配置225 mL17．5%氯化钠肉汤溶液，加入到500 mL锥形瓶中，灭菌并凉至适宜温度。量取样品A 25 mL至锥形瓶中，于36℃ ±1℃摇床培养18～24 h后观察。

(3)将上述培养物划线接种到B－P平板上，36℃ ±1℃培养18～24 h或45～48 h后观察菌落形态;

将上述培养物划线接种到血琼脂平板上，36℃ ±1℃培养18～24h后观察菌落形态。

(4)挑取B－P平板或血琼脂平板上的可疑菌落1个或以上，采用革兰氏染色法进行染色，制作玻片进行镜检，观察细菌形态。

(5)挑取B－P平板或血琼脂平板上的可疑菌落1个或以上，分别接种到5 mLBHI和营养琼脂小斜面，36℃ ±1℃培养18～24 h。

(6)取新鲜配置兔血浆0．5 mL，放入小试管，加入BHI培养物0．2～0．3 mL，震荡摇匀，置36℃ ±1℃温箱或水浴箱中，每半小时观察一次，观察6 h，如呈现凝固(将试管倾斜或倒置时，呈现凝块)或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。

3．2 微生物自动鉴定仪法［5］

(1)将样品A接种到营养琼脂平板上，36℃ ±1℃培养18～24 h，采用革兰氏染色法进行染色，制作玻片进行镜检，观察细菌形态，如有疑似的葡萄球菌，则进行下一步实验。

(2)在小试管中加入3 mL灭菌的4．5%生理盐水，挑取可疑菌落，加入试管中，用电子浊度仪测试浊度在0．5左右。

(3)将试管放入卡架左侧，GP卡放入右侧，试GP卡蓝色管插入菌液中，放入仪器，进行操作。实验完成后，在电脑中查看鉴定结果。

4 实验结果

4．1 标准方法

4．1．1 营养琼脂平板

如图1a，菌落较小，圆形湿润，具有金黄色光泽。

4．1．2 7．5%氯化钠肉汤溶液

图1d为未接种前7．5%氯化钠肉汤溶液，图1e为接种后培养24 h的7．5%氯化钠肉汤溶液，可见明显浑浊。

4．1．3 B －P 平板结果

如图1b，菌落为棕黑色，周围有透明环。

4．1．4 血琼脂平板结果

如图1c，菌落较大，有透明溶血环。

4．1．5 革兰氏染色结果

如图1f，革兰氏染色阳性，蓝紫色，球菌。

4．1．6 血浆凝固酶实验结果

如图1 g，兔血浆发生凝集反应，证明有凝血浆酶产生。

图1 实验结果

4．2 微生物自动鉴定仪法

梅里埃VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定结果见图2。

图2 梅里埃VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定结果鉴定结果:金黄色葡萄球菌，置信度:99%，耗时:4．25 h。

5 结论与展望

由各个实验结果可以确定样品A中确实存在金黄色葡萄球菌，且标准方法和微生物自动鉴定仪法均可以检测出正确结果。通过标准方法检测需要分别进行6项实验，耗时4～5 d，而使用微生物自动鉴定仪VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定系统获得实验结果仅需4．25 h。由此可见，微生物自动鉴定仪比标准方法更加快速，且节省人工。并且VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定系统的最大载荷为30张卡，即一次最多可以检测30个样品，一次鉴定过程约6～8 h，效率更高。

在目前的食品安全国家标准中，对于金黄色葡萄球菌的定性试验尚无微生物自动鉴定仪鉴定方法的介绍，随着检测科技的更新，微生物自动鉴定仪在生物、医药、食品卫生检验等方向的应用会更加广范。