银线草HPLC－ESI－MS的研究

袁琴琴

(菏泽学院农业与生物工程学院，山东菏泽 274000)

银线草(Chloranthus japonicusSieb．)为金粟兰科金粟兰属多年生的草本植物，以根或者全草入药，具有消炎止痛、解蛇毒等功效，在民间应用广泛［1－2］。银线草中的酚酸类和香豆素在其主要活性成分之一，现代药理学研究表明，酚类成分和香豆素类成分具有良好的抗氧化、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗激素、抗血栓、抗变态反应等活性［3－6］。由于它们特殊的生理作用，研究酚类和香豆素类化合物具有十分重要的意义。目前，单体化合物提取比较困难，本研究通过液相质谱联用技术对银线草中的主要成分进行质普检测，根据各个色谱的ESI质谱信息和色谱图中主要峰的出峰时间以及各化学成分的相对分子质量，结合前人的文献对迷迭香酸、反丁烯二酸、异秦皮啶、绿原酸进行了初步表征。

1 实验材料和仪器

1．1 实验材料

银线草样品于2010年7月底采集于陕西省太白山，经生命科学院田先华教授鉴定为金粟兰科金粟兰属植物银线草(Chloranthus japonicusSieb．)。

1．2 实验试剂

甲醇(美国Fisher公司，色谱纯);甲酸(天津市天力化学试剂有限公司，分析纯);所用水均为超纯水;标准品:迷迭香酸(批号:07902PH)，异秦皮啶(批号:110837－200707)，反丁烯二酸(批号:11154－200001)，绿原酸(批号:110753200413)(中国药品生物制品检定所)。

1．3 实验仪器

LC2010 AHT HPLC(日本SHIMADZU岛津公司);SL202N型电子秤(上海民桥精密科学仪器有限公司);MILLI－Q超纯水仪器(MILLIPORE公司);RE250AA旋转蒸发仪器(上海亚荣生化仪器公司);KQ5200超声波清洗器(江苏省昆山市超声仪器有限公司);色谱柱 Phenomenex C18(250 mm×4．6 mm，5 μm)(美国Phenomenex公司);SL202N型电子秤(上海民桥精密科学仪器有限公司);色谱柱Phenomenex C18(250 mm×4．6 mm，5 μm)(美国 Phenomenex公司)。

2 实验方法

2．1 标准品溶液的制备

适量精密称取反丁烯二酸、异秦皮啶、绿原酸和迷迭香酸标准品，用甲醇溶解配置混合标品，溶液须经0．22μm有机相滤膜过滤。

2．2 银线草溶液制备

太白山地点的银线草粉末1 g，加5 mL的70%甲醇超声提取30 min两次，合并提取液，摇匀，用0．22 m微孔滤膜滤过，即得银线草样品溶液。

2．3 实验方法

2．3．1 色谱条件

色谱柱采用 Phenomenex C18(250 mm ×4．6 mm，5μm)流动相:A磷酸水，B甲醇:脱条件条件:0～5 min，甲醇15% ～25%;5～20 min，甲醇 25% ～30%;20～45 min，甲醇 30% ～40%;45 ～95min，甲醇40% ～60%。B;流速0．8 mL/min;检测波长323 nm;柱温25℃;记录时间95 min;进样量10μL。

2．3．2 质谱条件

干燥气流速4 L/min，干燥气温度180℃，电喷雾离子化(ESI)，负离子方式检测，Auto MSn，扫描范围50～1000 m/z。

3 结果分析

通过样品及标准品的色谱峰的MS数据和出峰时间以及相关文献报道进行比较分析，初步鉴定出4个化合物。

1号峰。银线草样品和反丁烯二酸标品的HPLC出峰时间均为6．5 min(图3);银线草样品溶液在6．5 min一级质谱显示出分子离子［M－H］－的m/z与反丁烯二酸标品的ESI质谱图得到的信息一致，均为115(图1、2)。根据以上信息，初步推断该物质反丁烯二酸，相对分子质量为116。化学结构如图4。

2号峰。银线草样品和绿原酸标品的HPLC出峰时间均为15．9 min(图3)，银线草样品溶液在15．9 min一级质谱显示出分子离子［M－H］－的m/z与绿原酸标品的ESI质谱图显示的信息一致，m/z均为353(图1、2)，根据以上信息，初步推断该物质为绿原酸，相对分子质量为354，首次发现。化学结构如图4。

图1 标准品的ESI质谱图Fig．1 TIC spectrum of standard compounds

图2 银线草样品的ESI质谱图Fig．2 TIC spectrum of Chloranthus japonicus Sieb

图3 标品的HPLCFig．3 HPLC of standard compounds

3号峰。异秦皮啶标品出峰时间为29．8 min(图3)，银线草样品在同样时间出峰，银线草样品溶液在29．9 min一级质谱显示出分子离子［M－H］－的m/z为353，而异秦皮啶ESI质谱图显示其准分子离子的m/z却为221(图1、2)，综合该物质的HPLC出峰时间和ESI质谱信息，初步推断该物质为异嗪皮啶，相对分子质量为222，化学结构如图4所示。

4号峰。迷迭香酸标品出峰时间为58．3 min(图3)，银线草样品在同样时间出峰，迷迭香酸ESI质谱图显示其准分子离子［M－H］－的m/z为359(图1、2)，银线草样品溶液一级质谱显示出分子离子［M－H］－的m/z为359，综合该物质的HPLC出峰时间和ESI质谱信息，初步推断该物质为迷迭香酸，相对分子质量为360，化学结构如图4所示。

图4 化学式Fig．4 Chemical formula

4 结论

质谱技术是鉴定化合物的一种手段，具有高选择性和高灵敏的优点，而液相质谱技术融合了具有高效的分离能力的高效液相方法以及能够提供相对分子质量与结构信息的质谱方法。这种技术不但弥补了紫外检测的不足，还可以提供化学成分的信息，在未知化合物结构的探索上和新药的研究及开发中发挥着重要的作用。

本实验采用高效液相色谱技术根据其出峰时间和ESI质谱信息，初步确定银线草中含有反丁烯二酸，异嗪皮啶、绿原酸和迷迭香酸。为全面分析其活性成分和银线草药材的质量考察指标提供资料