河源地区3879例非综合征型耳聋致病基因突变分析

刘晓燕，邬丽红，曾秋娜，刘运华

(河源市妇幼保健院检验科，广东 河源 517000)

遗传性耳聋属于常见的先天性疾病，多因单一基因突变或不同基因的复合突变引起，医疗、环境、创伤、药物等为主要的客观诱发因素[1]。遗传性耳聋具有较高的发病率，是威胁人们健康的重要疾病之一。相关调查[2]数据显示，在我国残疾人口中，超过2780万为听力残疾者，占全国8296万残疾人的31%，占世界听障人群的25%。另有数据[3]调查显示，世界各国每新出生1000名新生儿，便有1名为先天性耳聋患儿。在此背景下，必须加强遗传性耳聋的防治工作，以降低遗传性耳聋的发病率。因此，加强对遗传性耳聋相关致病因素的分析至关重要。本研究纳入河源市妇幼保健院2018年7月至2019年6月的3879例非综合征型耳聋患者，分析致病基因突变情况。报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

3879例非综合征型耳聋患者，男2094例(53.98%)，女1785例(46.02%)，其中3847例是新生儿，采集的标本有90%以上是脐带血。根据患儿的发病情况、病史和全面的影像学检查结果，结合病状表现和体征，均确诊为非综合征耳聋。排除听力下降外伴有其他临床症状者和综合征型耳聋患者。

1.2 方法

1.2.1 相关物品

全血基因组提取试剂盒购自潮州凯普生物化学有限公司，PCR-导流杂交法耳聋易感基因检测试剂盒(离心柱型)、PCR扩增仪ABI7300购自美国赛默飞世尔科技公司，医用核酸分子快速杂交仪HHM-2、核酸分子杂交仪HB-2012A购自广东凯普生物科技股份有限公司。

1.2.2 DNA分离提取

患者或其监护人获悉耳聋相关知识后，抽取被检测者脐带血或外周静脉血2 mL，EDTA-K2抗凝，取血液100 μL，采用凯普全血基因组提取试剂盒(离心柱型)提取基因组DNA,使用分光光度计检测纯度，满足OD260/280=1.7～2.0，取2 μL抽提好的DNA样本作为模板进行PCR扩增，剩余DNA样品保存于-20 ℃的冰箱中备用。

1.2.3 PCR-导流杂交法

对标本破裂细胞膜以释放DNA，在高浓度盐溶液中将核酸吸附在硅类介质表面，并在低盐浓度中将洗脱下来的DNA进行PCR扩增，GJB2、GJB3、mtDNA和SLC26A4基因引物参考相关文献[3-4]设计。1)扩增体系：2组PCR混合液各27.5 μL，主要成分包括Buffer、dNTPs、氯化镁；Taq酶1 μL(5 U·μL-1)，ddH2O(50 mL)。扩增程序：①95 ℃变性 9min；②95 ℃变性30 s，55 ℃温度下退火30 s，72 ℃延伸60 s，40个循环；③72 ℃延伸5 min；降温至16 ℃扩增完成。2)杂交体系：杂交液(SSC、0.1%SDS),洗脱液WBI(SSC、0.1%SDS)，封阻液(TBS、脱脂奶粉、吐温-20)，酶标液(链霉亲和素碱性磷酸酶)，溶液A(TBS、吐温-20)，杂交膜(氨基化探针、尼龙膜)，显色液(NBT/BCIP)。杂交过程：①95 ℃变性5～10 min，冰水浴至少2 min；②45 ℃导流杂交。3)显色分析结果。

1.2.4 统计学方法

应用SPSS12.0软件处理数据，比较采用χ2检验，以P<0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 非综合征型耳聋致病基因检测结果

3879例非综合征型耳聋患者中，检测出致病基因携带患者148例，检出率为3.82%。

2.2 各种携带基因突变携带情况的分析

在致病基因携带率方面，GJB2和SLC26A4高于GJB3和mtDNA，差异有统计学意义(P<0.05)；GJB2和SLC26A4相比较，差异无统计学意义(P>0.05)；GJB3和mtDNA相比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各种携带基因突变携带情况的分析

3 讨论

50%患儿的耳聋与遗传因素有关，70%的遗传性耳聋不伴有其他症状，称为非综合征性耳聋；非综合征耳聋是最常见的感音神经性聋，可以分为四类，分别为线粒体遗传性耳聋(1%)、性连锁(DFN X-linked，1%)、常染色体显性(DFNA，15%～20%)和常染色体隐性(DFNB，80%)[5]。相关研究[6]表明，绝大部分的迟发性听力下降患者中，其致病因素中包括自身基因缺陷所致，或由于基因缺陷和多态性造成对致聋环境因素易感性增加而致病。我国遗传性耳聋患者所涉及的主要是线粒体DNA(mtDNA)、SLC26A4、GJB2和GJB3 4种基因的突变。其中，mtDNA基因突变主要包括1494M、1555M、7445M和12201M；SLC26A4基因突变主要包括IVS-M、1229M、2168M；GJB2基因突变主要包括35M、155M、176M、235M和299M；GJB3突变主要以538M为主。

遗传性耳聋有很高的遗传异质性，与耳聋相关的基因至少有100个，这给临床检测带来了很大的困难。目前，传统基因诊断方法中。酶切、限制性片段长度多态性分析、变性高效液相色谱分析等是较为常见的诊断方法，尽管具有良好的诊断效果，但是也存在相应的局限，如不能定性、耗时费力、所需设备和耗材昂贵等，最为重要的是难以同时对不同基因的多个突变位点进行检测[7]。以APEX、Invader等芯片检测技术为例，可以同时针对数百个突变位点进行高通量检测，但检测周期最长可达8周，而且检测成本相对较高，对除点突变之外的其他突变类型的检出能力有限，PCR-导流杂交法采用生物素标记的引物分别对耳聋基因突变区域进行特异性扩增，将扩增产物与标记不同突变类型耳聋基因探针的尼龙膜在导流杂交仪上进行导流杂交，然后通过化学显色对结果进行判读[8]。

本研究针对PCR-导流杂交技术检测河源地区4种耳聋易感基因，通过分析被检者的DNA，确认与耳聋相关的基因是否存在，取得了理想的效果。研究结果显示，经PCR-导流杂交法检测出致病基因携带患者148例，检出率为3.82%。进一步分析各基因突变携带率，发现GJB2和SLC26A4携带率比较高，均超过了40%，并且远高于GJB3和mtDNA的携带率，差异有统计学意义(P<0.05)，这可为耳聋的临床诊断提供依据，对致聋基因的寻找和检测有着重要的意义。

综上所述，河源地区非综合征型耳聋患者中，GJB2和SLC26A4突变基因的携带率比较高，GJB3和mtDNA基因突变的携带率较低，加强对该地区非综合征耳聋患者致病基因突变的分析，了解该地区耳聋基因的突变谱，可为该地区乃至全国耳聋基因型分布提供数据支持，同时也为耳聋的早期诊断和治疗提供参考。