祖师麻片对牛Ⅱ型胶原诱导大鼠关节炎的药效学研究

程 龙，张天睿，董世芬，马 丹，宋敬怡，张仲毅，张硕峰*

（1.北京中医药大学，北京 100029；2.山海关药业有限责任公司，河北 秦皇岛市 066200）

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种常见的自身免疫性疾病，其特征主要是手、足小关节的多关节、对称性、侵袭性关节滑膜炎症以及软骨损伤[1]。目前，现代医学对RA的发病机制尚未明确，一般认为与遗传、环境等因素有关[2]。临床治疗RA的药物有非甾体抗炎药、抗风湿药和植物药制剂等，然而，这些药物长时间服用具有严重的毒副作用，如胃肠道损伤、肝毒性以及增加心血管疾病的风险等[3-4]。

祖师麻为瑞香科植物黄瑞香（Daphne giraldii Nitsche）、陕甘瑞香（Daphne tangutica Maxim）及凹叶瑞香（Daphne retusa Hemsl）的茎皮和根皮，具有祛风通络，散瘀止痛。研究发现，祖师麻具有抗炎、镇痛、抗菌、抗肿瘤等药理作用[5-7]。祖师麻片[8]用于治疗风湿痹痛、关节炎、类风湿性关节，但其具体药效机制尚不清楚。本研究采用牛Ⅱ 型胶原诱导的关节炎（collagen-induced anhritis，CIA）动物模型，来观察祖师麻片对CIA模型大鼠类风湿性关节炎的药效学影响，并探讨其可能的机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物 健康6周龄SPF级Wistar大鼠80只，雌雄各半，体质量（200±20）g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。合格证号：11400700241427，11400700249067。所有大鼠饲养于北京中医药大学屏障环境动物实验室[SYXK（京）2016-0038]，室温（25±2）℃、45%相对湿度，12 h/12 h光暗周期，饲养期间大鼠自由进食及饮水。

1.2 试剂及药品 祖师麻片购于秦皇岛市山海关药业有限责任公司，批号为20160302；雷公藤多苷片购于湖北千金协力药业有限公司，批号为20170302；戊巴比妥钠购于北京化学试剂公司，批号为020402；弗氏不完全佐剂购于Sigma公司，批号为SLBQ2284V；牛II型胶原乳化剂购于Biotopped公司，批号为C7806；COX-2 、CTGF、RF、IgG、IL-6、PGE-2、TNF-α ELISA试剂盒购于Bluegene公司，批号分别为20170728、20170728、20171023、20170820、20180302、20180302、2018030。

1.3 仪器 半自动轮转式切片机（德国徕卡（Leica）仪器有限公司）；正置智能型显微镜（奥林巴斯（中国）有限公司）；全自动多功能酶标仪（Thermo）；电热恒温培养箱(天津泰斯特)。

1.4 实验方法

1.4.1 动物造模 参照文献[9]方法，配制牛II型胶原乳化剂（每毫升乳剂含1 mg 牛II型胶原）。实验时，于大鼠自尾根部皮内注射 0.1 mL 牛II型胶原乳剂，14 d后即第15天用同样方法相同剂量再次加强注射第2次。正常对照组每次注射等剂量的生理盐水。每周称取一次体质量并记录。

1.4.2 CIA模型评价 从第2次注射牛II型胶原乳化液开始，每天观察造模大鼠关节的红肿程度，对大鼠关节炎指数进行评分（AI评分）。AI评分判断标准[10]：0分：前爪和后足没有肿胀和局部发红；1分：个别足趾轻度红肿；2分：踝关节或腕关节轻度肿胀；3分：前爪、后足和关节严重发炎；4分：前爪、后足畸形或关节僵硬。每只大鼠均做观察评分，评分总和即为CIA大鼠的AI评分。每隔1天计算一次。

1.4.3 分组与给药 第二次注射牛II型胶原乳化剂后7 d，选取60只AI＞2的大鼠，用随机分配法分为模型组、雷公藤多苷片组（阳性对照组）、祖师麻肠溶制剂高、中、低剂量组组、每组12只。正常组12只。雷公藤多苷片，按体临床人最大用量为1.5 mg/（kg·d），即大鼠受试剂量为临床人用量的6倍，即给药剂量为9 mg/（kg·d）；祖师麻片9.9 g生药/人/d（按祖师麻片药典内容计算），按体质量75 kg计算，即1.32×102mg生药/kg，大鼠受试剂量分别为临床用量的12、6、3倍，即1.584×103mg、7.92×102mg、3.96×102mg生药/kg。上述药品溶于羧甲基纤维钠溶液，共灌胃给药10 d，1次/d，正常组、模型组给予等量羧甲基纤维钠溶液。

1.4.4 取材 在给药10 d后取材。大鼠以1.5%戊巴比妥钠45 mg/kg腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，离心制备血清。沿后肢正中纵行切开皮肤直至暴露出膝关节，剪断膝关节，放入4%多聚甲醛固定液中固定。

1.4.5 ELISA法检测测血清中生长因子、免疫因子、风湿因子及炎症因子 ELISA法测定大鼠血清中CTGF、IgG、RF、COX-2、IL-6、PGE-2 和 TGF-α含量。

1.4.6 膝关节番红O-固绿染色 取每组大鼠膝关节脱钙后做石蜡切片，切片脱蜡至水；铁苏木素液染核；流水冲洗；静水放置；番红 O 染液滴染 ；95% 乙醇分化；自来水洗；60 ℃ 预热固绿滴染；蒸馏水急洗一次；番红 O 染液复染 ；95% 乙醇分化；自来水洗。镜下观察关节软骨的一般形态，并对膝关节软骨进行Mankin’s 评分。膝关节软骨Mankin’s 评分原则依据文献[11]。

1.5 统计学处理 实验数据采用SAS 8.2 软件进行统计，结果用平均数±标准差（±s ）表示，多组间数据比较采用单因素方差分析法（one-way ANOVA），2组间比较采用独立样本t检验。以P＜0.05为有显著性差异。

2 结果

2.1 祖师麻片对CIA模型大鼠AI评分的影响 见表1。

2.2 祖师麻片对CIA模型大鼠血清中生长因子、免疫因子及风湿因子的影响 见图1。

2.3 祖师麻片对CIA模型大鼠血清中炎症因子的影响 见图2。

表1 祖师麻片对CIA大鼠AI评分的影响（±s ，n =12）

注：与模型组比较，# P＜0.05，## P＜0.01

组 别 剂量/[mg/（kg·d）] 给药前AI评分 给药后AI评分2 d 4 d 6 d 8 d 10 d正常对照组 - 0.0±0.0## 0.0±0.0## 0.0±0.0## 0.0±0.0## 0.0±0.0## 0.0±0.0##模型组 - 6.7±1.0 6.4±1.4 6.1±1.4 6.0±0.8 5.8±0.7 5.3±1.5雷公藤多苷片组 9 6.4±1.3 5.6±1.3 5.4±1.2 4.9±0.9# 4.3±0.8## 3.3±1.0##祖师麻片组3.96×102 6.1±1.8 5.9±1.7 5.6±1.5 5.3±1.3 5.1±1.2 4.5±0.9#7.92×102 5.9±1.6 5.7±1.9 5.3±1.0 5.2±1.3 4.6±1.1# 3.7±1.4##1.584×103 6.3±1.2 5.5±1.4 5.4±1.2 4.9±1.1# 3.9±1.0## 3.6±1.0##

图1 祖师麻片对CIA模型大鼠血清中生长因子、免疫因子及风湿因子的影响

图2 祖师麻片对CIA大鼠血清中炎症因子的影响

2.4 膝关节软骨番红O-固绿染色 如图3所示，各组大鼠膝关节番红固绿染色比较，正常组大鼠膝关节软骨结果光整如常，软骨细胞数量正常，软骨着色正常，潮线完整（图3A）。模型组大鼠膝关节软骨表面出现裂痕，软骨细胞数量减少，染色重度减少，软骨下骨血管入侵潮线（图3B）。雷公藤多苷片组（图3C）、祖师麻高（图3D）、中（图3E）、低（图3F）剂量组软骨细胞数量稍有减少，染色丢失较模型组少，潮线基本完整。

2.5 祖师麻片对CIA大鼠膝关节软骨Mankin’s 评分比较 见图4。

图3 各组大鼠膝关节软骨番红O-固绿染色（× 400）

图4 祖师麻片对CIA大鼠膝关节软骨Mankin’s评分比较

3 讨论

牛Ⅱ型胶原诱导的关节炎（collagen-induced anhritis，CIA）动物模型是研究类风湿性关节炎公认的模型，在国际上已广泛应用于类风湿关节炎的基础研究和抗类风湿关节炎特效药物的研究[12]。目前，RA的临床诊断标准主要依靠急性期反应物和血清中相关因子（如：CTGF、RF、IgG等）含量多少及症状持续的长短[13-14]。本研究结果显示，与模型组相比，祖师麻片高剂量组能显著的降低大鼠血清中结缔组织生长因子、风湿因子、免疫球蛋白G含量，提示祖师麻片可能通过调节机体免疫对RA起治疗作用。AI评分是衡量RA的又一标准参数[15]。本研究中，模型组大鼠前爪和后足红肿、关节严重发炎，其AI评分与正常组比较显著增加。环氧化物酶-2是花生四烯酸（arachidonic acid，AA）转化为前列腺素的限速酶，是炎性细胞的前体的控制酶。非甾体抗炎药物主要通过抑制COX-2的活性，从而阻断AA的转化，继而降低PGE的大量生成，发挥抗炎作用[16]。IL-6是在感染和炎症反应中显著上调的细胞因子，在RA发病机制中起关键作用，导致滑膜细胞和关节周围结构的破坏，此外，IL-6也参与B淋巴细胞的成熟、产生自身抗体等，造成患者关节的病变[17]。研究发现，TNF-α是RA发病机制中关键的致炎因子，诱导滑膜增生、软骨/骨破坏和全身炎症反应，且在RA发作后TNF-α水平显示出“昼高、夜低”的24 h节律性变化[18]。本研究中，模型组大鼠血清中炎症因子COX-2、IL-6、PGE-2、TNF-a含量显著增加，膝关节软骨表面出现裂痕，软骨细胞数量减少，染色重度减少，软骨下骨血管入侵潮线，Mankin’s评分显著增加。祖师麻片不同剂量干预后，其AI评分及血清中COX-2、PGE-2、IL-6、TNF-α的含量显著降低，可减轻CIA模型大鼠膝关节软骨结构破坏的范围和严重程度，并具有促进软骨细胞增生的作用。祖师麻片不同剂量给药组Mankin’s评分显著降低也证实了其保护软骨损伤的作用。

综上所述，祖师麻片对Ⅱ 型胶原诱导的类风湿关节炎有显著改善作用，在治疗RA具有重要价值，其机制可能与抗炎、免疫调节作用有关。但其更深入的机制尚未完全清楚，因此，进而研究更深层次的机制具有重要的意义。