心肌缺血再灌注损伤对mir-499水平表达及免疫学的影响①

杨 伟 王燕琼 李媛华 邵建林 白向峰

(昆明医科大学第一附属医院麻醉科，昆明620032)

急性心肌梗死(Acute myocardiol infarction，AMI)是冠状动脉急性、持续性缺血、缺氧引起的心肌坏死，临床表现为剧烈、持久的胸骨后疼痛，且患者休息并给予硝酸甘油类药物难以完全缓解，部分患者可伴有心肌酶活性增高及进行性心电图变化，严重者将会引起心律失常、休克或心力衰竭[1]。溶栓和经皮冠脉介入是治疗AMI主要方法，能降低患者病死率。但是，其所致的再灌注损伤影响预后，且患者治疗后心力衰竭发病率在45%以上。缺血再灌注损伤则是指机体遭受一段时间缺血的组织恢复灌注后，缺血组织损伤程度不但没有减轻反而急速加剧，常见诱因包括：血管内皮功能障碍、心肌细胞凋亡、收缩功能障碍及再灌注心律失常等，影响患者心脏功能[2]。

microRNA是一类由20～25个核苷酸构成的高度保守的内源性单链非编码RNA，在高等生命中发挥了重要作用，能直接参与生物细胞的增殖、分化、凋亡、免疫等[3，4]。通过前期基因预测软件分析看出：mir-499可能参与心肌缺血再灌注损伤发生、发展。mir-499具有心肌细胞特异性，仅在心肌细胞表达，在心肌肥厚、心力衰竭、心脏电生理传导中发挥重要的作用。国外学者实验结果表明[5]：在心肌缺血再灌注损伤中，再灌注24 h内可在梗死周边检测到T细胞，且在随后的3～7 d持续性增加。由此看出：T淋巴细胞能在心肌缺血再灌注损伤中发挥重要作用，但是与microRNA的关系缺乏研究。因此，本课题以2016年12月～2018年2月在我院进行实验的SD大鼠60只为研究对象，探讨心肌缺血再灌注损伤对mir-499水平表达及免疫学的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1一般资料 选择2016年12月～2018年2月在我院进行实验的SD大鼠60只，随机选取大鼠20只设为空白对照组。剩余40只SD大鼠建立心肌缺血再灌注损伤模型，建模成功后随机分为缺血后处理组(n=20)和心肌缺血再灌注损伤组(n=20)。60只SD大鼠，雄性，清洁级，体质量220～270 g，平均(190.35±0.83)g，所选动物均由医学动物实验中心提供。SD大鼠常规饲养，自由摄食、饮水，光照12 h，建模前12 h禁食，试验均通过医院动物委员会批准同意。

1.1.2主要仪器和试剂 研究所需仪器与试剂包括：DAB Kit酶底物显色试剂盒、白洋 G16 型台式高速离心肌、中性树胶、石蜡切片机(LEICA-RM2235型)、电热恒温培养箱(HH.BII 型)、光学显微镜及Msho数字成像系统、mRNA逆转录试剂盒、引物设计合成、PVDF膜及PCR等，其厂家见表1。

1.2方法

1.2.1心肌缺血再灌注损伤模型的建立 60只SD大鼠随机取20只设为空白对照组，其余40只SD大鼠参与心肌缺血再灌注损伤模型建立，建模方法如下：采用改良垫扎球囊法完成SD大鼠动物模型建立。取参与建模的SD大鼠，采用0.35 mg/g浓度3.5%水合氯醛经腹腔注射麻醉，待麻醉生效后进行常规消毒、铺巾。取仰卧位姿势，经气管插管后连接动物呼吸机，设定相关参数：潮气量2～3 ml/100 g，频率为80次/min，呼吸比为1∶1，连接Ⅱ导联动态监测大鼠心电图。上述操作步骤完成后帮助SD大鼠快速开胸，将心包膜撕开后在左侧心耳下缘、肺动脉圆锥部位采用6-0可吸收缝合线经过左侧冠状动脉前降支深部完成心大静脉、 注水球囊结扎。 将结扎线收紧，使得球囊压迫左侧冠状动脉前降支，建立缺血模型。结扎完毕后缺血部位呈浅红色，室壁运动减弱，导致心电图下ST段升高。缺血30 min后迅速将球囊中水吸除，解除血管压迫，对于缺血部位发绀消失、心电图下ST段恢复正常或下降50.0%以上视为动物建模成功。心肌缺血再灌注损伤组建模后不采取任何措施处理干预；缺血后处理组建模成功后再进行30 s灌注、30 s缺血，连续进行3次处理[6，7]。

表1 主要仪器和试剂

1.2.2心功能测定 采用经胸超声心动图对三组大鼠心脏功能进行评估，测量：左室舒张末期容积(LVEDV)、左室收缩末期容积(LVESV)、左室射血分数(LVEF)及左室短轴缩短率(LVFS)[8，9]。

1.2.3mir-499水平测定 ①组织中RNA的提取。三组大鼠建模、干预后以断颈方式处死大鼠，去心肌部位组织，经过PBS冲洗后加入500 μl Trizol吹打，使得组织充分溶解，加入500 μl Trizol充分混合、均匀。将上述溶液放入常温下5 min，溶解蛋白体，加入0.2 ml氯仿，剧烈振荡15 s，常温下放置2～3 min，12 000 r/min离心15 min，获得三层液体(上层为水相、中间层与下层为有机相)。取RNA沉淀，转移到新的EP管中，加入0.5 ml异丙醇，充分混合后放置在-20℃冰箱中，12 000 r/min离心10 min，可见凝胶状沉淀(即为RNA)。充分洗涤RNA，并加入250 μl DEPC与750 μl乙醇，利用乙醇完成沉淀的冲洗，7 400 r/min离心5 min，取沉淀放入工作台上干燥20 min。利用紫外分光度仪检测RNA浓度并完成RNA提纯(以Rnase作为空白对照)，在A260下测定吸光度值。采用Dnase酶处理RNA，处理完毕后放入冰箱中，备用。②逆转录反应(完成cDNA的合成)。取获得的RNA 1 μg、OligodT 1 μl，加水保证总体积为12 μl，充分混合后5 min水浴，冰上静置1 min，加入5 μl缓冲液、1 μl Rninhib-itor及2 μl dNTP，保证总体溶液体积为12 μl，10 min 水浴，温度设定为42℃，反应完毕后放置在-20℃冰箱中备用。③PCR反应。mir-499引物上游设定为：5′-GCCAGTTGTTTTTCTGATTTGTGGGCC-3′,下游引物设定为：5′-GCCAGTTGTTTTTCTG-CCAC-3′，为403 bp，hGAP-DH引物上游：5′-GGCTCTCCAGAACATCAT-3′，下游：5′-CACCTGGTGCTCAGTGTA-3′，为240 bp。根据每一例标本情况设定反应条件：94℃下进行5 min变性，94℃下30 s、55℃下30 s、72℃ 1 min，连续进行35个循环，最后72℃下完成10 min延长。取hGAPDH为内参，选择获得的扩增产物，放入1.5%琼脂凝胶进行电泳，完毕后采用UVP凝胶图像完成灰度值的测定[10，11]。

1.2.4细胞免疫学水平测定 三组大鼠处理后7 d空腹状态下经尾部取静脉血3 ml，5 000 r/min离心15 min，完成血清分离后放置在-20℃冰箱中，备用。采用流式细胞仪测定三组CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+水平，有关操作严格遵循仪器操作说明书完成[12，13]。

1.2.5相关性 采用SPSS Pearson相关性分析软件对心肌缺血再灌注损伤大鼠mir-499水平与T淋巴细胞水平进行相关性分析。

2 结果

2.1三组心功能水平比较 见表2。三组手术前LVEDV、LVESV、LVEF及LVFS水平比较无统计学意义(P>0.05)；缺血后处理组、空白对照组LVEDV水平无统计学意义(P>0.05)；缺血后处理组灌注后LVESV水平，低于心肌缺血再灌注组(P<0.05)；缺血后处理组灌注后LVEF及LVFS水平，均高于心肌缺血再灌注组(P<0.05)。

表2 三组心功能水平比较

Note：Vs myocardial ischemia-reperfusion injury group，1)P<0.05；vs blank control group,2)P<0.05.

表3 三组mir-499表达比较

Note：Vs myocardial ischemia-reperfusion injury group，1)P<0.05；vs blank control group，2)P<0.05.

表4 心肌缺血再灌注损伤mir-499水平与免疫学指标相关性(r，P)

表5 三组大鼠细胞免疫学水平比较

Note：Vs myocardial ischemia-reperfusion injury group,1)P<0.05；vs blank control group,2)P<0.05.

2.2三组mir-499水平比较 见表3。缺血后处理组mir-499水平高于心肌缺血再灌注损伤组和空白对照组(P<0.05)；心肌缺血再灌注损伤组mir-499水平低于空白对照组(P<0.05)。

2.3心肌缺血再灌注损伤mir-499水平与免疫学指标相关性 见表4。SPSS Pearson相关性分析结果表明：心肌缺血再灌注损伤mir-499水平与CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平呈负相关性(P<0.05)，与CD8+水平呈正相关性(P<0.05)。

2.4三组大鼠细胞免疫学水平比较 见表5。缺血后处理组、心肌缺血再灌注损伤组CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平，均高于空白对照组(P<0.05)；缺血后处理组、心肌缺血再灌注损伤组CD8+水平，均低于空白对照组(P<0.05)；缺血后处理组CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平，均低于心肌缺血再灌注损伤组(P<0.05)；缺血后处理组CD8+水平，均低于心肌缺血再灌注损伤组(P<0.05)。

3 讨论

AMI是在冠状动脉粥样硬化病变的基础上并发粥样块破裂、出血，血管腔内血栓形成，从而引起血管发生急性闭塞，导致心肌细胞进行性坏死[14,15]。目前，对于AMI以溶栓、经皮冠脉介入治疗为主，虽然改善冠状动脉，促进血流恢复，降低临床死亡率，但是临床上不宜忽视由缺血引起的再灌注损伤[16]。从大的角度来说，缺血再灌注损伤是指机体遭受一段时间缺血组织恢复灌注后，缺血的组织损伤程度不但没有得到缓解，反而急速加剧，能引起血管内皮功能障碍、收缩功能障碍[17,18]。但是，缺血再灌注损伤过程中对于组织造成损伤的并不是缺血本身，而是恢复灌注后大量钙离子内流及过量的活性氧自由基产生，从而引起组织细胞凋亡。心肌梗死区域存在凋亡、坏死两种细胞死亡形式，且多以凋亡为主(占80.0%以上)，而坏死仅占20.0%，并且多数由凋亡转化而来。本研究中，缺血后处理组灌注后LVESV水平，低于心肌缺血再灌注组(P<0.05)；缺血后处理组灌注后LVEF及LVFS水平，均高于心肌缺血再灌注组(P<0.05)。由此看出：心肌缺血再灌注后心功能水平会发生明显的改变，但是经缺血再灌注后则能减轻心肌功能变化。由于缺血后处理组灌注后组织损伤并未得到缓解与改善，反而出现加重趋势，导致心功能水平进一步降低。但是，经过缺血后处理后机体心功能将会得到提高[19,20]。

microRNA是一种高度保守的内缘性小分子单链、非编码的RNA，能通过靶mRNA特异性序列互补配对相互结合，从而能抑制靶基因的生成。同时，microRNA产生转录后能实现基因表达的调控[21,22]。国内学者研究表明：miRNA参与心肌缺血再灌注损伤，并且在IPC、IPO介导的心肌缺血损伤的保护中发挥作用[23]。mir-499是myomiRs家族一员，多表达于心肌、骨骼肌慢肌纤维组织中，而在其他组织中表达量相对较少，在人体心肌细胞分化、再生中均发挥了重要的作用[24,25]。生理条件下，内源性miRNA的表达能维持在一个恒定的水平，但是当受到病理或生理刺激时其表达水平能发生变化。本研究中，缺血后处理组mir-499水平高于心肌缺血再灌注损伤组和空白对照组(P<0.05)；心肌缺血再灌注损伤组mir-499水平低于空白对照组(P<0.05)。由此看出：mir-499水平在心肌缺血再灌注损伤患者中呈高表达，能参与心肌缺血再灌注损伤的发生、发展，能抑制PDCD4表达水平减少心肌细胞的凋亡，从而能改善缺血再灌注损伤大鼠心脏功能。

积极采取有效的措施防治心肌缺血再灌注损伤是提高心脏手术成功率，促进患者术后恢复的关键[26]。国外学者研究表明[27,28]：免疫、炎症反应是心肌缺血再灌注损伤的重要机制。中性粒细胞是缺血再灌注损伤的主要炎症细胞，但是最新研究表明CD3+、CD4+细胞在心肌缺血再灌注损伤中发挥效应，尽早采取有效的措施抑制CD3+、CD4+细胞聚集能实现对缺血再灌注心肌的保护。本研究中，缺血后处理组CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平，均低于心肌缺血再灌注损伤组(P<0.05)；缺血后处理组CD8+水平，均低于心肌缺血再灌注损伤组(P<0.05)。由此看出：心肌缺血再灌注损伤加速了CD3+、CD4+细胞的聚集。国内学者研究表明[29]：缺血再灌注损伤整个过程中对于组织产生的损伤不是缺血本身，而是灌注过程中产生的大量钙离子内流及氧自由基的大量产生。为了验证心肌缺血再灌注损伤后处理方法，本研究中设立心肌缺血处理组，在大鼠心肌缺血后予以短暂的再灌注缺血循环，然后恢复灌注，结果表明：该后处理方法能缩小心肌梗死面积，实现心肌的保护，减轻缺血再灌注损伤，能为心肌缺血再灌注损伤治疗提供方法和思路。本研究中，SPSS Pearson相关性分析结果表明：心肌缺血再灌注损伤mir-499水平与CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平呈负相关性(P<0.05)，与CD8+水平呈正相关性(P<0.05)。因此，心肌缺血再灌注损伤治疗过程中可以加强免疫细胞水平，评估治疗预后，根据检测结果调整治疗方案，降低死亡率[30]。

综上所述，心肌缺血再灌注损伤会引起mir-499表达降低，经缺血处理后mir-499水平得到提高，有助于改善大鼠心脏功能，且与免疫学水平具有一定的相关性。