枫杨提取物对MH7A细胞增殖和凋亡的影响及其机制研究①

武璐璐 王翔鹏 张全书 朱 健 袁 林 向 阳

(湖北民族学院医学院，恩施445000)

类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是以滑膜组织的过度增生、血管翳形成和骨侵蚀为病理特点的慢性自身免疫性疾病[1]。虽然RA的病因病机尚不明确，但关节滑膜是其公认的治疗靶器官，成纤维样滑膜细胞(Fibroblast-like synoviocytes，FLS)的异常增殖和凋亡不足在RA发病中起关键作用[2,3]。当今世界新药已从化合物合成转向天然药物开发，以雷公藤、白芍总苷为代表的抗风湿中草药研究已取得了较好的成果[4-6]。我国幅员辽阔、资源丰富，不同地区、不同民族在与风湿病做斗争的过程中，在中草药应用上积累了丰富的经验。湖北枫杨(Pterocarya Hupehensis Skan)作为土家药在恩施地区常用于治疗风湿筋骨疼痛[7]。在本实验中，我们选取湖北枫杨作为研究对象，用不同浓度的湖北枫杨各提取物作用于体外培养的人类风湿关节炎成纤维滑膜细胞MH7A，观察其对MH7A细胞增殖和凋亡的影响，并对其诱导MH7A细胞凋亡的可能机制进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞 人类风湿关节炎成纤维滑膜细胞株MH7A，购自Biovector NTCC公司。

1.1.2药品与主要试剂 湖北枫杨由我院中草药标本中心集中采购，经袁林副教授鉴定为胡桃科(Juglandaceae)湖北枫杨属(Pterocarya Kunth)植物的干燥茎皮；无水乙醇、石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇(上海沪试国药集团股份有限公司)；二甲基亚砜(美国Sigma公司)；胎牛血清、胰蛋白酶、双抗(美国 Gibco 公司)；DMEM高糖培养基(美国HyClone公司)；CCK-8试剂盒(上海碧云天生物技术研究所)；Annexin V/FITC 细胞凋亡试剂盒(美国BD公司)；Caspase-3、Caspase-9的酶活性检测试剂盒(美国Biovision公司)；Trizol提取试剂盒(美国Invitrogen公司)；逆转录试剂盒(美国Thermo Scientific公司)；实时荧光定量PCR相关试剂盒(日本TaKaRa公司)；扩增引物(上海生物工程股份有限公司)；Cyt-C、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Bcl-2、BAX抗体(美国 Abcam 公司)；β-Actin抗体、HRP羊抗兔二抗(武汉博士德生物工程有限公司)等。

1.2方法

1.2.1湖北枫杨各提取物的制备 取湖北枫杨干燥茎皮1 kg，粉碎，加75% 的乙醇10 L，置于超声仪中萃取3次。将3次的萃取液合并、过滤、离心去渣、浓缩，得乙醇提取液。取100 ml备用，将剩余的乙醇提取液依次用等量石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，分别合并得各提取液，浓缩。将上述5类提取液分别真空冷冻干燥，最终得到湖北枫杨各提取物的干燥固体。取乙醇、乙酸乙酯、正丁醇提取物各1 g，加适量的PBS水溶解，取石油醚、氯仿提取物各1 g，加适量的DMSO溶解；然后用 0.22 μm 的无菌滤器过滤，密封后置于4℃冰箱。用时取出，加适量DMEM培养基(不含血清和双抗)，配成所需浓度，其中终浓度的DMSO含量低于1‰。

1.2.2细胞培养 将MH7A细胞接种于含10% 胎牛血清和1%双抗的DMEM高糖培养基中，置于5%CO2、100% 湿度、37℃ 恒温培养箱中培养；当细胞融合到70%～80%时用PBS洗2次，用含0.25% 胰蛋白酶和0.02% EDTA 的消化液消化，含血清的DMEM培养基终止消化后按1∶2 传代，进行实验。

1.2.3CCK-8检测细胞增殖率 取对数生长期的MH7A细胞制成5×104个/ml的单细胞悬液，每孔100 μl接种于96孔板。待细胞贴壁生长12 h后，将原有培养基更换为含湖北枫杨不同提取物的培养基。将细胞分为5组，分别为湖北枫杨乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇提取物组，每组的终浓度分别为3.125、6.25、12.5、25、50、100、250、500、1 000、2 500和5 000 μg/ml。同时设置阴性对照组(有细胞、培养基，无湖北枫杨提取物)和空白对照组(仅有培养基)。分别培养6、12、24 h后，每孔加入10 μl的CCK-8试剂，继续培养2 h，酶标仪检测450 nm时的吸光度值，计算细胞增殖率。实验独立重复3次。

1.2.4流式细胞术检测细胞凋亡率 取对数生长期的MH7A细胞制成5×105个/ml的细胞悬液，每孔2 ml 接种于6孔板。待细胞贴壁生长12 h后，将原有培养基更换为含湖北枫杨乙醇提取物的培养基。将细胞分为阴性对照组(无湖北枫杨乙醇提取物)、不同剂量药物组(湖北枫杨乙醇提取物终浓度分别为25、50和100 μg/ml)，培养24 h后，消化、离心收集细胞，将细胞密度调整为1×106个/ml，用4℃ 的PBS洗2次，1×Buffer重悬细胞，取100 μl细胞悬液于流式管中，依次加入FITC标记的 Annexin-V和PI各5 μl混匀后避光孵育15 min，再加入400 μl的1×Buffer终止孵育，用流式细胞仪检测细胞凋亡率，Flowjo 软件分析数据。实验独立重复3次。

1.2.5Caspase-3、Caspase-9酶活性检测 分别用终浓度为25、50和100 μg/ml的湖北枫杨乙醇提取物作用于生长融合到80% 的MH7A细胞24 h，同时设置阴性对照组(无湖北枫杨乙醇提取物)，收集各组细胞，PBS洗涤后加入相应体积4℃ Lysis buffer于冰上裂解10 min，离心收集上清即得含裂解液的蛋白质。Bradford法测定蛋白浓度。各组取150 μg蛋白，用相应Lysis buffer稀释至50 μg，分别加入对应的2×reaction buffer 50 μl(内含0.5 μl DTT)和5 μl 的Caspase-3或Caspase-9反应底物，37℃ 恒温箱避光孵育2 h。酶标仪测量405 nm时的吸光度值，计算Caspase-3和Caspase-9酶活性。实验独立重复3次。

1.2.6Western blot法检测凋亡相关蛋白表达 分别用终浓度为25、50和100 μg/ml的湖北枫杨乙醇提取物作用于生长融合到80%的MH7A细胞24 h，同时设置阴性对照组(无湖北枫杨乙醇提取物)，提取各组细胞总蛋白，用BCA法测蛋白浓度后平衡各组蛋白浓度，加入相应体积SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)，100℃ 煮沸10 min。各组取15 μl混匀液进行SDS-PAGE电泳，电转移至PVDF膜上，5% 脱脂牛奶室温水平摇床上封闭1 h，TBST洗膜3次,每次5 min，分别加相应一抗Cyt-C(1∶1 000)、Cleaved Caspase-3(1∶800)、Cleaved Caspase-9(1∶800)、Bcl-2(1∶1 000)和BAX(1∶1 000)，4℃ 孵育过夜，洗膜后加入HRP标记的二抗(1∶10 000)，室温水平摇床上孵育2 h。洗膜后加入ECL发光剂，用凝胶成像系统拍照成像。用Quantity One软件分析条带灰度值，以内参β-acting作对照，计算各组目的蛋白的相对表达量。实验独立重复3次。

1.2.7实时荧光定量 PCR 检测相关蛋白mRNA表达 分别用终浓度为25、50和100 μg/ml的湖北枫杨乙醇提取物作用于生长融合到80% 的MH7A细胞24 h，同时设置阴性对照组(无湖北枫杨乙醇提取物)，用Trizol法提取细胞总RNA，检测RNA浓度和纯度后按照试剂盒说明步骤将其逆转录为cDNA。选用10 μl的实时荧光定量PCR反应体系(荧光染料5 μl，上、下游引物各0.4 μl，去离子水3.2 μl，cDNA 1 μl)。反应条件为：95℃ 15 s，58℃1 min，重复40个循环。分析以GAPDH的表达量为参照，采用公式2-ΔΔCt计算基因表达的相对倍数变化。实验独立重复3次。引物序列见表1。

1.3统计学处理 采用SPSS22.0进行统计分析，数据进行方差齐性和正态性检验，两组数据间比较

采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05或P<0.01时差异有统计学意义。

2 结果

2.1湖北枫杨各提取物对MH7A细胞增殖的影响 如图1所示，与阴性对照组相比，各浓度的湖北枫杨石油醚、正丁醇提取物在6、12和24 h对MH7A细胞增殖均无明显的抑制作用。氯仿、乙酸乙酯提取物分别从500 μg/ml和1 mg/ml起在6、12和 24 h 对MH7A细胞增殖有抑制作用(P<0.05或P<0.01)；3.125、6.25和12.5 μg/ml 的乙醇提取物在6 h时对MH7A细胞增殖无明显抑制作用，但在12 h 和24 h时对其增殖有抑制作用，其余各浓度乙醇提取物在6、12和24 h对MH7A细胞增殖均有抑制作用(P<0.05或P<0.01)，随时间延长而增加，但无剂量依赖关系。当浓度为25、50和100 μg/ml时MH7A增殖率有明显改变，且随着药物浓度的增加细胞增殖率逐渐下降，100 μg/ml时对其增殖抑制作用最强(P<0.05)， 此后药物浓度增加， 对其增殖抑制作用反下降。基于本实验后续选择浓度为25、50和100 μg/ml的乙醇提取物干预MH7A细胞24 h来进行相关实验。

表1 实时荧光定量PCR引物序列

图1 湖北枫杨不同提取物对MH7A细胞增殖的影响Fig.1 Effect of Pterocarya Hupehensis Skan different extracts on proliferation of MH7A cellsNote: At the same time，each drug group was compared with the negative control group,*.P<0.05，* *.P<0.01;compared with the 50 μg/ml concentration group，#.P<0.05;compared with 25 μg/ml concentration group，△.P<0.05;compared with 25 μg/ml concentration group，▲.P<0.05.

2.2湖北枫杨乙醇提取物对MH7A细胞凋亡的影响 如图2所示，正常生长的MH7A细胞凋亡不明显(凋亡率<5%)，用25、50和100 μg/ml的湖北枫杨乙醇提取物干预后，MH7A出现明显的凋亡(P<0.01)，凋亡率随药物浓度的增加而升高(P<0.05)。

2.3湖北枫杨乙醇提取物对Caspase-3和Caspase-9酶活性的影响 如图3所示，用25、50和100 μg/ml的湖北枫杨乙醇提取物干预后，各浓度作用组MH7A细胞内Caspase-3和Caspase-9酶活性均高于阴性对照组(P<0.05)，其中100 μg/ml浓度作用组细胞内Caspase-3、Caspase-9酶活性最高(P<0.05)。

图2 湖北枫杨乙醇提取物对MH7A细胞凋亡的影响Fig.2 Effect of Pterocarya Hupehensis Skan ethanol extract on apoptosis of MH7A cellsNote: At the same time，each drug group was compared with the negative control group，* *.P<0.01;compared with the 50 μg/ml concentration group，#.P<0.05;compared with 25 μg/ml conce-ntration group，△.P<0.05;compared with 25 μg/ml concentration group，▲.P<0.05.

图3 湖北枫杨乙醇提取物对Caspase-3和Caspase-9酶活性的影响Fig.3 Effect of Pterocarya Hupehensis Skan ethanol extract on enzyme activity of Caspase-3 and Caspase-9Note: At the same time，each drug group was compared with the negative control group，*.P<0.05，* *.P<0.01;compared with the 50 μg/ml concentration group，#.P<0.05.

2.4湖北枫杨乙醇提取物对MH7A细胞相关凋亡蛋白表达的影响 如图4所示，与阴性对照组相比，25 μg/ml湖北枫杨乙醇提取物作用组MH7A细胞内Cyt-C蛋白相对表达量增加不明显，其余各浓度作用组细胞内Cyt-C蛋白相对表达量增加(P<0.05)；各浓度作用组细胞内Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9和BAX蛋白相对表达量均明显增加(P<0.05或P<0.01)；各浓度作用组细胞内Bcl-2蛋白相对表达量均降低(P<0.01)。

图4 湖北枫杨乙醇提取物对MH7A细胞相关凋亡蛋白表达的影响Fig.4 Effect of Pterocarya Hupehensis Skan ethanol extract on protein expression related to apoptosis of MH7A cellNote: At the same time，each drug group was compared with the negative control group，*.P<0.05，* *.P<0.01;compared with the 50 μg/ml concentration group，#.P<0.05;compared with 25 μg/ml concentration group，△.P<0.05;compared with 25 μg/ml concentration group，▲.P<0.05.

图5 湖北枫杨乙醇提取物对MH7A细胞相关凋亡蛋白mRNA表达的影响Fig.5 Effect of Pterocarya Hupehensis Skan ethanol extract on expression of mRNA related to apoptotic protein of MH7A cellsNote: At the same time，each drug group was compared with the negative control group，*.P<0.05，* *.P<0.01;compared with the 50 μg/ml concentration group，#.P<0.05;compared with 25 μg/ml concentration group，△.P<0.05;compared with 25 μg/ml concentration groupd，▲.P<0.05.

2.5湖北枫杨乙醇提取物对MH7A细胞凋亡相关蛋白mRNA表达的影响 如图5所示，与阴性对照组相比，25 μg/ml湖北枫杨乙醇提取物作用组MH7A细胞内P53、BAX和BAK的mRNA表达增加不明显，其余各浓度作用组细胞内P53、BAX和BAK的mRNA表达明显增加(P<0.05或P<0.01)；各浓度作用组细胞内Bcl-2和Bcl-xL的mRNA表达降低(P<0.01)。

3 讨论

在本试验中用湖北枫杨不同部位提取物分别作用于体外培养的MH7A细胞，通过CCK-8法和流式细胞术发现湖北枫杨抑制MH7A细胞增殖的活性部位是乙醇、氯仿和乙酸乙酯提取部，其中乙醇部位提取物对MH7A细胞增殖抑制作用最强，并可有效诱导MH7A细胞凋亡。细胞凋亡是由病理学家Kerr 等[8]提出的一个不同于坏死的细胞死亡新概念，它是一个主动、高度有序、由特定基因调控以及一系列特异性酶参与的过程。其形态学改变表现为：胞质浓缩，核染色质凝缩，细胞膜内陷，凋亡小体形成等[9,10]。线粒体作为真核生物能量和代谢的中心，亦是调控细胞凋亡的重要细胞器，线粒体凋亡通路是细胞凋亡的重要途径之一[11]。

线粒体诱导的细胞凋亡途径中最关键的步骤是Cyt-C从线粒体内的释放。释放的Cyt-C进入胞浆后与细胞内存在的一种凋亡细胞蛋白酶激活因子(Apaf-1)结合，在dATP或ATP存在的条件下，使Caspase-9发生剪切活化[12]。位于Caspase级联反应上游的Caspase-9是线粒体凋亡途径中最重要的启动子，正常情况下以无活性酶原形式存在于细胞中，当受到凋亡信号刺激后可经蛋白酶水解成大、小亚单位，与Cyt-C和Apaf-1等形成凋亡复合体，进而激活Caspase-3等下游的凋亡执行子，从而导致凋亡的发生[13]。其中Caspase-3作为细胞凋亡的关键执行者，亦是多种凋亡途径传导的汇聚点，它的活化标志着凋亡进入不可逆阶段[14]。用湖北枫杨乙醇提取物作用MH7A细胞后，细胞内Caspase-3和Caspase-9酶活性及活化的Caspase-3和Caspase-9的蛋白表达增加，说明湖北枫杨乙醇提取物可通过增加Cyt-C的释放，激活Caspase级联反应来诱导MH7A凋亡。Bcl-2家族是作用于线粒体的另一类细胞凋亡的关键调节分子，线粒体是其调控内在凋亡途径的靶点[15]。Bcl-2家族包括抗凋亡成员(Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w和Al/Bfl-1等)和促凋亡成员(BAX、Bad、BAK、Bid和Bim/Bod等)[16,17]。湖北枫杨乙醇提取物作用于MH7A细胞后，细胞内BAX的蛋白表达及BAX和BAK的mRNA表达增加，Bcl-2的蛋白表达及Bcl-2和Bcl-xL的mRNA表达降低，促凋亡和抑凋亡蛋白的比率升高。Bcl-2家族中促凋亡和抑凋亡蛋白的比率可协调线粒体内、外膜的渗透性，当促凋亡和抑凋亡蛋白的比率升高时可使线粒体外膜通透性增加，引起Cyt-C等膜间隙蛋白释放，激活下游Caspases级联反应，启动凋亡[18,19]。

此外，我们还发现湖北枫杨乙醇提取物可增加肿瘤抑制蛋白P53的mRNA表达。P53一方面可通过调控Bcl-2家族蛋白促进线粒体膜通透性转运孔开放，造成Cyt-C的释放，进一步激活Caspase级联反应，诱导凋亡[20-22]；另一方面，P53可直接激活BAK、上调BAX而诱导Cyt-C的释放，或与亲环素CyclophilinD结合，开放线粒体膜通道孔，进而诱导凋亡[23-25]。

因此，推测湖北枫杨乙醇提取物诱导MH7A细胞凋亡的可能机制是通过调控细胞内Cyt-C、Caspase-9、Caspase-3、BAX、BAK、Bcl-2、Bcl-xL 和P53的表达，从而激活线粒体凋亡途径，诱导MH7A细胞凋亡，为利用和开发湖北枫杨治疗RA提供实验和理论基础，使之能更好地服务临床，造福患者。而湖北枫杨乙醇提取物是如何具体影响线粒体途径的传导机制，以及是否还通过其他途径达到诱导MH7A细胞凋亡，抑制其增殖的目的，我们将在后续的试验中进行研究和探索。