电针联合威灵仙关节腔内注射对大鼠膝骨关节炎TNF-α、MMP、HA及TIMP-1的影响

高 晶 刘学政

(锦州医科大学人体解剖学教研室，锦州121001)

膝关节骨性关节炎(Knee osteoarthritis，KOA)，是一种以膝关节的软骨变性、破坏与骨质增生为主要病理改变的慢性关节性疾病[1，2]。研究显示，该种疾病在我国中老年人群中的发病率为12%～15%，其主要临床表现为关节的疼痛、肿胀和功能障碍[3]。在近些年以来，随着我国人口老龄化的趋势越来越严重，KOA的发病率与致残率直线上升，这不仅对患者本人的生存质量与身体功能构成严重的影响，对于家庭与社会也是一个沉重的负担[4]。KOA可以分为原发性与继发性两种，其中的难点在于原发性KOA，由于该种类型的KOA无法找到确定的发病原因，所以也很难找到有效的治疗方法[5]。一般对于KOA的治疗原则为缓解患者的疼痛，延缓病情发展，尽量避免出现膝关节的畸形改变，改善肢体功能，提升生存质量为主。目前已经在临床上使用的治疗方法主要有物理疗法、药物干预、针灸、运动康复与手术等，但是仍然缺少得到普遍认可的方法[6，7]。在中医理论中认为KOA属于筋痹和骨痹的辨证。中医理论认为KOA的发病与气滞血瘀和关节局部的湿浊痹阻有着密切的关联。由于外伤、关节滑膜损伤、感染、疼痛等因素刺激膝骨关节滑囊的毛细血管扩张而且通透性上升，大量的组织液渗出到关节腔内形成关节积液。在以往利用中医方法对KOA进行治疗的过程中，往往强调的是舒筋通络，行气止痛和活血化瘀[8-10]，但是由于以往的研究结果均无法取得令人满意的结果，所以对于新式治疗方法的探索始终没有停止。威灵仙总皂苷是威灵仙的干燥根部与根茎部在化学萃取之后制成的灭菌注射液，其中包括有威灵仙皂苷元、黄酮类、常春藤齐墩果酸等物质，可以抑菌消炎，清热利尿等。在《本草纲目》中记录威灵仙可以通经络，祛风湿，散癖积，通行十二正经，止痹痛[11，12]。但是威灵仙联合电针的方法可以取得何种的效果尚没有文献进行报道。有鉴于此，本研究选择电针联合威灵仙关节腔内注射的方法对大鼠进行干预，探讨该种治疗方法的动物实验效果。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1仪器与试验动物 选择SD大鼠60只，雌雄各一半，实验动物购自锦州医科大学实验动物中心，实验动物设施使用许可证编号：SYXK(桂)2015-0030，实验动物生产许可证编号：SCXK(桂)2015-0037，动物等级为普通级。复方威灵仙注射液购自太和语言药剂科制剂中心，总皂苷含量超过50%，使用时利用无菌蒸馏水配置成所需浓度的混悬液。弗氏完全佐剂购自山东西亚化学工业有限公司。SDZ-III型电子针灸治疗仪(华佗牌)，全自动生化仪(美国贝克曼博尔特AU5800)，试剂盒购自上海恒源生物科技有限公司。

1.1.2大鼠的分组方法及结果 将全部的实验大鼠按照随机数字的方法分为4组，对照组(A组)，电针治疗组(B组)，威灵仙治疗组(C组)和电针联合威灵仙治疗组(D组)，每组15只大鼠。

1.2方法

1.2.1大鼠模型制备方法 参照文献[13]中的模型制备方法制作大鼠的KOA模型，具体方法如下：全部大鼠首先进行备皮与消毒，利用剃须刀将大鼠右前肢膝关节部位及以下的毛剃干净，然后利用75%酒精对皮肤进行消毒。消毒完成后利用注射器将0.1 ml弗氏完全佐剂注射到右前侧膝关节内，分别于第1天、第3天、第7天各注射1次，每日强制大鼠进行活动60 min,7 d后如果观察到大鼠出现如下症状时可以显示为模型制作成功：右前侧膝关节出现红肿热痛，同时伴有软组织的肿胀或者出现积液，右前侧膝关节和周围出现僵硬与活动程度受限，右前侧膝关节病理检查结果显示关节腔内出现大量渗出液，软骨表面不光滑，出现滑膜增生或者黏连等关节炎病理改变，实验室检查结果显示相关细胞因子的浓度发生明显变化。

1.2.2各组大鼠的治疗方法 A组大鼠不给予任何治疗，仅每日对右前侧膝关节利用75%酒精消毒。B组大鼠给予电针治疗，具体方法如下：将大鼠固定在固定架上，在右前侧取穴，以三阴交、足三里、行间、血海、太冲与阳陵泉为主穴，利用由内向外斜刺3分。在主穴以下旁开0.5 cm作为配穴，利用导气手法使用一次性无菌针灸刺入骨膜中，将三阴交、足三里、行间、血海、太冲与阳陵泉作为正极，以各自的配穴作为负极，得气之后接电子诊疗仪进行连续波刺激，频率保持在10 Hz左右，连续刺激15 min。每日治疗1次，连续治疗2周。C组大鼠给予威灵仙注射液进行关节腔内注射，具体方法如下：在大鼠右前侧关节腔内进行威灵仙注射液的注射，剂量为0.2 ml/次，每日注射一次，连续治疗2周。D组大鼠利用电针联合威灵仙治疗，电针疗法具体同B组，威灵仙治疗具体同C组，连续治疗2周。

1.2.3观察指标 对4组大鼠的一般情况进行比较，如月龄、性别、体重等。对4组大鼠治疗前后的关节积液中的透明质酸(HA)含量与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量进行对比。测定方法为直接抽取大鼠右前侧膝关节腔的积液，以3 500 r/min离心15 min 后取上层血清，利用酶联免疫吸附法进行测定，使用全自动生化仪进行分析。

对4组大鼠治疗前后血清中的基质金属蛋白酶(MMPs)进行对比，包括MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9以及基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)。参照文献[14]中的操作方法，取得大鼠眼眶静脉血，以3 500 r/min离心15 min后取上层血清，利用酶联免疫吸附法进行测定，使用美国贝克曼博尔特AU5800全自动生化仪进行测定，试剂盒购自上海恒源生物科技有限公司。

对4组大鼠治疗前后的足肿胀度进行对比。参照文献[15]中的操作方法对足肿胀度进行测量，首先在50 ml量筒中放入蒸馏水，要求液面达到量筒最高处。使用20 ml注射器将20 ml蒸馏水吸出。在大鼠右前侧膝关节缝的矢状面做一个标记，然后将大鼠的右前肢放入量筒内，要求做标记处与量筒最高处齐平。然后将大鼠移开，利用已经吸入20 ml蒸馏水的注射器向量筒内注入蒸馏水，并要求液面与最高处齐平，读取注射器内剩余蒸馏水的体积。右前侧膝关节容积=20 ml-注射器内剩余液体体积，反复操作3次取算术平均值。足肿胀度(%)=(实测容积-造模前容积)÷造模前容积×100%。对4组大鼠的肿胀消退时间进行对比。

2 结果

2.14组大鼠的一般情况比较结果 在4组大鼠的一般情况比较中，月龄、性别、体重数据差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.24组大鼠治疗前后的关节积液中的透明质酸(HA)含量与TNF-α含量对比结果 4组大鼠治疗前的HA、TNF-α比较，差异均无统计学意义(F=9.482，9.121，P>0.05)。治疗后，4组大鼠的HA数值均高于治疗前，TNF-α数值均低于治疗前，差异均有统计学意义(t=2.074，2.055，4.213，4.079，4.479，4.922，9.482，9.121，P<0.05)，在治疗后的组间比较中，数据差异有统计学意义(F=47.561，58.996，P<0.05)，q检验结果显示，HA为D组高于B组与C组，B组与C组又高于A组，TNF-α为D组低于B组与C组，B组与C组又低于A组，见表2。

2.34组大鼠治疗前后血清中的基质金属蛋白酶(MMPs)及基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)对比结果 4组大鼠治疗前的MMPs比较，数据差异均无统计学意义(F=1.337，2.011，2.152，2.221，P>0.05)。治疗后，4组大鼠的MMPs数值均低于治疗前，数据差异均有统计学意义(t=2.104，2.056，2.085，2.319，3.910，3.976，3.345，3.067，3.585，3.453，4.148，3.317，5.298，4.890，5.817，4.243，P<0.05)，在治疗后的组间比较中，数据差异有统计学意义(F=79.632，49.663，50.657，87.669，P<0.05)，q检验结果显示，MMPs数值均为D组低于B组与C组，B组与C组又低于A组。

4组大鼠治疗前的TIMP-1比较，数据差异均无统计学意义，治疗后，4组大鼠的TIMP-1数值均高于治疗前，数据差异均有统计学意义(均P<0.05)，在治疗后的组间比较中，数据差异有统计学意义(均P<0.05)，TIMP-1数值均为D组高于B组与C组，B组与C组又高于A组，详见表3。

2.44组大鼠治疗前后的足肿胀度对比结果 4组大鼠治疗前的足肿胀度比较，数据差异均无统计学意义(F=2.142，P>0.05)。治疗后，4组大鼠的足肿胀度数值均低于治疗前，数据差异均有统计学意义(t=2.094，4.049，5.510，12.332，P<0.05)，在治疗后的组间比较中，数据差异有统计学意义(F=59.658，P<0.05)，q检验结果显示，足肿胀度为D组低于B组与C组，B组与C组又低于A组，见表4。

2.54组大鼠的肿胀消退时间对比结果 在4组大鼠的肿胀消退时间比较中，数据差异具有统计学意义(F=45.661，P<0.05)，q检验结果显示，肿胀消退时间为D组低于B组与C组，B组与C组又低于A组，见表5。

表1 4组大鼠的一般情况比较结果

表3 4组大鼠治疗前后血清中的MMPs及TIMP-1对比结果

Note：qtest results:compared with group A，1)P<0.05;compared with group B,2)P<0.05;compared with group C,3)P<0.05;compared with group D,4)P<0.05.

表2 4组大鼠治疗前后的关节积液中的HA含量与TNF-α含量对比结果

Note：qtest results:compared with group A,1)P<0.05;compared with group B,2)P<0.05;compared with group C,3)P<0.05;compared with group D,4)P<0.05.

表4 4组大鼠治疗前后的足肿胀度对比结果

Note：qtest results:compared with group A,1)P<0.05;compared with group B,2)P<0.05;compared with group C,3)P<0.05;compared with group D,4)P<0.05.

表5 四组大鼠的肿胀消退时间对比结果

Note：qtest results:compared with group A,1)P<0.05；compared with group B，2)P<0.05；compared with group C,3)P<0.05；compared with group D,4)P<0.05.

3 讨论

膝关节骨炎经常出现关节的积液，其主要的病理改变是关节腔与滑膜的炎性反应，使关节面的软骨出现破坏与损伤，并且造成继发性的滑液炎症反应，可以导致关节软骨的合成与代谢过程发生紊乱。研究结果显示该种疾病多发于中老年人群中，而且主要临床表现为膝关节的变形，疼痛与活动受限[16，17]。尽管针对KOA的研究已经持续多年，但是目前对于原发性KOA的发病机制尚无统一的结论。以目前的研究结果看，多种因素均可能与KOA的发病相关，这其中包括有年龄因素、软骨代谢状况、内分泌情况、骨关节的劳损、关节囊内的高压状态、免疫因素与遗传易感性等。近年来，随着对KOA发病机制研究的深入，众多的结果显示，滑膜炎也是导致KOA发病的重要因素之一[18-20]。由于无法对KOA的发病机制做准确的判定，所以对其治疗方法的研究也无法找到正确的方向。虽然目前已经有多种方法可以使用对KOA治疗，但是其所取得的效果尚无法满足患者与医务工作者的要求。使用中医的方法与西医治疗方法进行联合，对KOA治疗是目前受到较大关注的一个突破方向。在中医理论中认为膝部的骨关节炎症主要是由于膝关节的局部湿浊痹阻与气滞血瘀所导致的，可以归属到筋痹与骨痹的范畴之内，治疗原则当以利湿除痹、舒筋通络、活血化瘀和行气止痛为主。膝关节由于某些原因导致关节滑膜出现损伤后，滑膜下层的毛细血管就会扩张，通透性上升，大量的渗出液就会积聚在关节腔内。中医认为该类患者为湿气下注入关节内，筋脉受阻，肾气亏损，经络受到淤滞[21]。

膝骨关节炎实验动物模型的制备方法，本次研究通过弗氏完全佐剂制备，弗氏完全佐剂注入大鼠单侧膝关节内，在较短时间内诱发结核杆菌的蛋白分子与关节滑膜糖蛋白分子的关节免疫反应，即大鼠形成类似于人体的膝骨关节炎病理状态，是免疫性关节炎动物模型的基本方法。

在本研究中利用大鼠作为实验对象，对电针联合威灵仙关节腔内注射的方法治疗KOA的效果进行了分析。其中复方威灵仙注射液主要是由威灵仙的干燥根与根茎加工而成，还含有独活、柴胡、白芷、川穹等成分。在诸多有效成分的作用下，可以起到消炎抑菌，清热解毒和强心利尿的功效。而利用电针进行相应穴位刺激的治疗方法也是中西医结合使用的一个典范。中医理论中认为膝关节受到外伤之后，局部关节的血行不畅，湿浊之气无法运化，因此可以利用针灸的方法行气止痛，舒筋活络。本研究中利用电针的方法对三阴交、足三里、行间、血海、太冲、阳陵泉进行刺激，因为中医认为对于以上穴位的刺激对于缓解KOA的症状有所帮助，其中三阴交为十总穴之一，刺激该穴位可以调肝补肾，调治水肿与湿浊之气运化不利；足三里为养血益气的穴位，刺激该穴位可以治疗下肢的萎痹之症；行间穴为人体足厥阴肝经上的主要穴道之一，可以治疗因肝气郁结引起的疾病；刺激血海，可以化血为气，运化脾血；刺激太冲穴可以治疗燥湿生风，主活血；阳陵泉与足三里的共同刺激，可以舒筋活血，利通关节。

在本研究中将全部的试验大鼠以随机数字的方法分为了4组，分别给予不同的干预方法。并以HA、TNF-α、MMPs及TIMP-1在治疗前后的变化对比说明干预的效果。关节积液中的HA主要为N-乙酰氨基葡萄糖胺二糖与D-葡萄糖醛酸所组成，在关节软骨的基质与滑液的组成中占有重要的比例，如果HA含量出现增高，则直接影响关节腔内前列腺E2等炎性介质的分泌与代谢，导致滑膜的通透性降低，使关节内的渗出液减少。TNF-α不仅仅是一种炎性介质，同样也是人体内的软骨基质降解的介质，该因子可以直接影响软骨细胞的基因表达，抑制软骨基质胶原与蛋白多糖的合成，并且促进其分解，最终对关节软骨造成破坏，另外在TNF-α的作用下可以出现滑膜成纤维细胞的增生，促进软骨降解，该因子还可以诱导其他细胞因子增生，共同介导对关节软骨的破坏。MMPs的种类不下20种，而在膝部的骨关节炎性病理改变中主要以MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-9为主，这其中又以MMP-1与MMP-9和膝关节炎病变的联系更加密切，因为这两种因子为细胞外基质降解的主要蛋白水解系统。研究表明，组织型金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)对MMPs的活性具有一定的调节作用，对关节退变具有保护性作用。本次研究结果显示，4组大鼠治疗前的TIMP-1比较，数据差异均无统计学意义，治疗后，4组大鼠的TIMP-1数值均高于治疗前，数据差异均有统计学意义(均P<0.05)，在治疗后的组间比较中，数据差异有统计学意义(均P<0.05)，TIMP-1数值均为D组高于B组与C组，B组与C组又高于A组。本次研究发现，组织型金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)与MMPs的抑制关系，能够相互结合和制约，是参与膝骨关节炎病程发展的重要物质，与刘苗苗等[22]研究结果相似。

研究结果显示，4组大鼠经过治疗后，HA、TNF-α、MMPs、TIMP-1和足肿胀度数值均出现了改善，但是从改善的幅度看，均为A组大鼠的幅度最小，B组与C组大鼠的幅度次之，D组大鼠的改善幅度最大，数据差异均具有统计学意义(P<0.05)。在4组大鼠的肿胀消退时间比较中，A组大鼠的消退时间最长，B组与C组大鼠的消退时间次之，D组的消退之间最短，数据差异也具有统计学意义(P<0.05)。此结果提示，A组大鼠尽管只是做了75%酒精的消毒，但是由于生物自我恢复的本能，其各项指标也出现了一定程度的改善，B组与C组分别进行了单独的电针刺激与单独的威灵仙关节腔内注射，其各类数据改善的效果就明显优于A组大鼠，这证实了两种治疗方法对于KOA确实可以取得一定的治疗效果，利用电针进行刺激可以激发气血循环，使患处的局部血液循环加速，也使局部病变组织的新陈代谢速度上升，减轻关节滑膜表面神经对于各类炎性因子刺激的敏感度，而威灵仙也可以较为明显地降低MMPs等因子的量，并且促使滑膜内衬B型细胞和单核吞噬细胞大量分泌HA，使关节腔内更加润滑，延缓软骨退变，保护关节软骨，所以B组与C组大鼠的恢复速度要显著快于A组。D组大鼠的恢复效果最好，可以理解为两种方法在联合使用的情况下，使疗效得到了提升，而且可以理解为两种方法在大鼠体内并没有产生拮抗，两种治疗方法的作用机制不同，但是却以中西医结合的方法使KOA的症状加速了消退，这也为两种方法在人体上的作用效果研究打下了良好的基础。

综上所述，利用电针联合威灵仙关节腔内注射方法干预膝骨关节炎的大鼠模型，可以提升治疗效果，改善TNF-α、MMPs、HA及TIMP-1的浓度状况，值得继续在人体试验方面做深入研究。