响应面法优化栀子中绿原酸的提取工艺

易梦媛，邓爱华，刘凤英，王 云，谢 鹏，卢俊明，王 志

（1.湖南文理学院生命与环境科学学院，湖南常德 415000；2.湖南文理学院芙蓉学院，湖南常德 415000；3.澧县扶农中药材农民专业合作社，湖南常德 415000）

0 引言

栀子（Gardenia jasminoides Ellis）作为我国传统药材，药用价值广泛[1-3]，主产于赣、鄂、闽、湘、浙等地[4-5]。绿原酸在栀子中作为有机酸脂类物质存在，其含量为0.003%~0.114%[6-7]，栀子可作为绿原酸的提取材料来源。绿原酸为极性有机酸，在常温水中的溶解度为4%左右[8]，因此试验中选取极性较强的甲醇作为提取溶剂，摸索出栀子中提取绿原酸的最佳工艺条件，以期为栀子中绿原酸的提取提供理论依据和生产指导。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

栀子果，湖南广源生物科技有限公司提供；绿原酸标准品，北京盛世康普化工技术研究院提供；甲醇（AR），德州润昕实验仪器有限公司提供；其他试剂（AR），国药试剂提供。

1.1.2 主要仪器设备

电子天平，赛多利斯有限公司产品；电热鼓风干燥箱、中草药粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司产品；数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司产品；高速离心机，上海安宁科学仪器厂产品；电热恒温水浴锅，上海一恒仪器有限公司产品；紫外分光光度计，上海元析仪器有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 绿原酸标准曲线制备

精密称取1.3 mg的绿原酸标准品，用体积分数50%甲醇溶液定容为100 mL，摇晃均匀，制成13 μg/mL 的母液。分别吸取 2，3，4，5，6，7，8，9，10 mL的母液于10 mL的容量瓶中加入50%甲醇定容至10 mL，得到质量浓度分别为2.6，3.9，5.2，6.5，7.8，9.1， 10.4，11.7，13 μg/mL 的标准溶液，以50%甲醇溶液为空白对照，于波长324 nm处测定吸光度。以绿原酸标准品质量浓度为横坐标（C）、吸光度为纵坐标（A），绘制标准曲线。得绿原酸的标准曲线方程为A=0.046C-0.017，R2=0.999 7，R接近于1，表明绿原酸质量浓度在0.170~0.513 mg/mL时与吸光度线性关系良好。

1.2.2 单因素试验

称取2.0 g栀子粉末，在超声功率70 W，超声时间25 min，甲醇体积分数50%，料液比1∶20，超声温度50℃的条件下，分别考查超声功率40，50，60，70，80，90，100 W；超声时间 15，20，25，30，35 min；甲醇体积分数30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，100%；料液比1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30；超声温度40，50，60，70，80℃时对栀子果粉中绿原酸提取率的影响。

1.2.3 响应面分析设计

通过单因素试验得到影响绿原酸提取的3个主要因素超声功率、超声时间、甲醇体积分数，确定其水平值，并使用Design Expert（Version 8.0.6） 软件对各因素及水平进行Box-Behnken响应面设计和数据分析。以A，B，C分别表示超声功率、超声时间、甲醇体积分数，每个因素的高中低水平分别以1，0，-1编码。

响应面试验因素及水平见表1。

表1 响应面试验因素及水平

1.2.4 样品中绿原酸含量测定

将所得绿原酸提取液以转速2 500 r/min离心8 min，取上层清液，用甲醇稀释100倍，用紫外分光光度计于波长324 nm处测定绿原酸的吸光度A324。以对应体积分数的甲醇溶液为空白对照。绿原酸提取量η（mg/g） 按如下公式计算：

式中：n——稀释倍数；

C——稀释后绿原酸质量浓度，mg/mL；

V——提取液总体积，mL；

m——干燥后栀子果实粉末的质量，g。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 超声功率对栀子中绿原酸提取率的影响

超声功率对栀子中绿原酸提取率的影响见图1。

图1 超声功率对栀子中绿原酸提取率的影响

从图1中可以看出，当超声功率为40~70 W时，绿原酸提取率随着超声功率的升高而不断增加，在70 W时达到最高值。继续增大超声功率，绿原酸提取率下降，可能是过高的超声功率导致绿原酸降解或其他杂质被提取出来影响绿原酸提取效果。

2.1.2 超声时间对栀子中绿原酸提取率的影响

超声时间对栀子中绿原酸提取率的影响见图2。

图2 超声时间对栀子中绿原酸提取率的影响

从图2中可以看出，15~20 min时绿原酸提取率上升最快，随后在20~25 min内有所减缓，至25 min时提取率达到最大值。之后，随着超声时间的延长提取率反而下降，在30~35 min内下降最快，可能是长时间的加热和超声导致绿原酸这种不稳定物质受热见光氧化分解及其他杂质析出导致提取率下降[9]。所以，选择提取效果最佳的25 min作为超声时间。

2.1.3 甲醇体积分数对栀子中绿原酸提取率的影响

甲醇体积分数对栀子中绿原酸提取率的影响见图3。

图3 甲醇体积分数对栀子中绿原酸提取率的影响

从图3中可以看出，甲醇体积分数在30%~50%时绿原酸提取率较低，变化不明显；甲醇体积分数在50%~70%时，绿原酸的提取率随甲醇体积分数的增加而快速上升；在甲醇体积分数达到70%时，绿原酸的提取量达最大（0.065 33 g）；而当甲醇体积分数大于70%时，提取率反而下降。可能是在低体积分数甲醇溶剂浸提下，果实中的果胶和蛋白质等黏稠状杂质容易浸出，体积分数差较小，绿原酸的浸提效果不佳；在高体积分数甲醇溶剂浸提下，提取率下降，可能是绿原酸结构中含有多个亲水性羟基基团，高体积分数甲醇中含水量少，绿原酸的提取率因此而下降。所以，选择70%甲醇体积分数作为提取溶液。

2.1.4 料液比对栀子中绿原酸提取的影响

料液比对栀子中绿原酸提取率的影响见图4。

图4 料液比对栀子中绿原酸提取率的影响

从图4中可以看出，在溶质质量不变的情况下绿原酸的提取率随着溶剂的增加而增加，可能是随着溶剂的增多绿原酸在甲醇中溶解的饱和度增高，固体与液体的接触面积加大，栀子中的绿原酸能够充分析出，增加了提取效果。

2.1.5 超声温度对栀子中绿原酸提取率的影响

超声温度对栀子中绿原酸提取率的影响见图5。

图5 超声温度对栀子中绿原酸提取率的影响

从图5中可以看出，超声温度在40~60℃时，绿原酸的提取率随着温度的升高上升明显；60℃时绿原酸的提取率也达到最大值（0.049 57 g）；而当超声温度为60~80℃时，绿原酸提取率下降明显，甚至绿原酸提取率的下降率要高于在40~60℃时绿原酸提取率的上升率。从图5曲线的变化趋势中也可以看出超声温度的升高有利于绿原酸的提取，但过高的超声温度也会导致绿原酸产生水解和出现分子内酯基迁移，异构化成新绿原酸和隐绿原酸，进而导致绿原酸的提取率下降[10]。所以，选择提取效果最佳的60℃作为超声温度。

2.2 响面分析试验结果

2.2.1 响应值结果及其拟合模型

选取超声功率、超声时间和甲醇体积分数3个因素，对提取工艺进行响应面分析。

响应面试验设计及结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果

2.2.2 模型方程的建立及显著性分析

在不同超声功率、超声时间、甲醇体积分数下测定的绿原酸提取率，利用Design Expert 8.0对表2中绿原酸提取率进行多元线性回归拟合。

绿原酸提取率回归模型及其显著性检验见表3。

表3 绿原酸提取率回归模型及其显著性检验

超声功率、超声时间和甲醇体积分数与绿原酸提取率的多元二次回归方程为：

式中：R——绿原酸提取率，%；

A——超声功率，W；

B——超声时间，min；

C——甲醇体积分数，%。

2.2.3 绿原酸提取率的响应面分析

利用Design Expert 8.0软件结合不同超声功率、超声时间和甲醇体积分数做出交互作用条件下的响应面图。

超声时间与超声功率对绿原酸提取率的影响见图6，甲醇体积分数与超声功率对绿原酸提取率的影响见图7，甲醇体积分数与超声时间对绿原酸提取率的影响见图8。

图6 超声时间与超声功率对绿原酸提取率的影响

图7 甲醇体积分数与超声功率对绿原酸提取率的影响

图8 甲醇体积分数与超声时间对绿原酸提取率的影响

从图6~图8中可以看出，3个影响因子单独对栀子中绿原酸提取率的影响大小依次为超声功率>甲醇体积分数>超声时间，而3个影响因子交互作用对栀子中绿原酸提取率的影响大小依次为超声功率、甲醇体积分数>超声功率、超声时间>甲醇体积分数、超声时间。从图6中可以看出，在过长或过短的提取时间下绿原酸提取率都不高，但在高超声功率下长时间的提取有利于绿原酸的析出。从图7中可以看出，在中等甲醇体积分数和中等超声功率下的绿原酸提取效果最佳。从图8中可以看出，在过长时间的甲醇中绿原酸的提取率会下降，在中等甲醇体积分数下短时间的提取有利于绿原酸的析出。

3 结论

采用超声波辅助甲醇提取绿原酸的最佳工艺参数为超声功率72.87 W，超声时间18.46 min，甲醇体积分数60.54%；在此条件下，绿原酸提取率为5.68%。超声功率、超声时间和甲醇体积分数对绿原酸提取率影响的程度大小依次为超声功率>甲醇体积分数>超声时间，3个影响因子交互作用对绿原酸提取率的影响程度大小依次为超声功率、甲醇体积分数>超声功率、超声时间>甲醇体积分数、超声时间。甲醇的极性和超声波产生的超声振荡及空穴效应有利于绿原酸的析出[11]，避免了绿原酸见光加热易分解的问题，缩短了提取时间，提高了提取效率。