龟甲人参鹿茸片主成分组方合理性研究
2019-04-12翟兴月冯明明佟长青
翟兴月,冯明明,佟长青,李 伟
(1.大连医科大学附属第二医院临床营养科,辽宁大连 116023;2.大连海洋大学食品科学与工程学院,辽宁大连 116023)
中药有药食同源的说法,因此有很多的中药既可以作为药品,赋予其药性功能,同时又可以作为保健食品的原料,利用其保健作用。2002年卫生部发布的《关于进一步规范保健食品原料管理的通知》中公布了可用于保健食品的人参等114种物品名单[1],龟甲、人参和马鹿茸都列其中。龟甲具有滋阴作用,因此具有较好的应用前景。但由于龟甲含有的碳酸钙为44.28%~55.85%,造成龟甲食用的不便,因此较少出现在保健食品中[2]。人参是重要的中药,同时它具有保健作用,如免疫调节和抗疲劳等,因此它也经常在保健品中使用[3]。鹿茸最早见于《神农本草经》,《中华人民共和国药典》中记载的鹿茸是鹿科动物梅花鹿(Cervus nippon Temminck,简称花鹿茸)或马鹿(Cervus elaphus Linnaeus,简称马鹿茸) 的雄鹿未骨化密生绒毛的幼角[4]。鹿茸具有大补阳虚、壮肾阳、调精血、强筋骨、调冲任、托疮毒的作用[5]。目前,市场上常见人参保健品、鹿茸保健品很多。中药的疗效特点在于多成分联合、剂量少、多靶点、需要长时间作用[6]。在有些方面,中药的复方优于单方。对于中药复方作用原理的研究,研究人员进行了大量的工作,其中以薛燕[6]提出的中药复方作用原理的“散弹理论”为大家所认可,这一理论后来发展为多靶点理论。赵军宁[7]认为中药复方作用的特点在于“杆秤原理”和适度原理。因此,可以认为中药复方具有较大的临床优势,以中药材为基础的复方保健食品同样具有这一优势。
龟鹿二仙膏是由龟板0.5 kg,鹿角1.5 kg,枸杞子300 g,人参150 g组成[8]。由此可见,由龟甲、人参、鹿茸为主要原料组成的保健品具有理论依据及合理性。龟甲具有的滋阴作用与人参、马鹿茸具有抗氧化、促进免疫功能的作用是一致的。因此,这3种物质组合起来依靠多靶点联合作用,可以充分发挥保健功效。试验对龟甲人参鹿茸片组方主成分合理性进行了研究,以期为开发龟甲人参鹿茸片保健食品提供基础数据。
1 材料与方法
1.1 材料
龟甲粉、鹿茸、人参,深圳市凯联健康生物科技有限公司提供提供。
绵羊红细胞(SRBC)、补体、Hank's液、鸡红细胞,北京索莱宝科技有限公司提供;RPMI1640培养液,美国Gibco公司提供;都氏试剂,Sigma公司提供。
6~7周清洁级昆明种小鼠,体重为18~22 g,雌性,购于大连医科大学实验动物研究中心。于12 h黑暗、12 h光亮的塑料饲养箱内饲养,室温23±2℃,湿度40%~60%,自由采食和饮水。
1.2 龟甲人参鹿茸片组方主成分可溶性蛋白质、多糖含量测定
不同组成的龟甲人参鹿茸片组方主成分按照质量体积比1∶100,加dH2O,于100℃下煮沸30 min后,冷却至室温,补加dH2O至初始时的量,以转速2 000 r/min离心20 min。取上清液,测定蛋白质含量及多糖含量。
蛋白质含量测定采用Folin-酚法,多糖含量测定采用苯酚-硫酸法。
1.3 抗体生成细胞测定
采用Jerne改良玻片法进行抗体生成细胞测定[9]。40只昆明种小鼠随机分为4组:对照组和3个组方组(组方1为龟甲2 g,人参2 g,马鹿茸0.5 g;组方2为龟甲2 g,人参3 g,马鹿茸 0.5 g;组方3为龟甲3 g,人参2 g,马鹿茸 0.5 g)。龟甲人参鹿茸粉悬溶于生理盐水中,每天定时等体积灌胃1次,按照0.45 g/(kg·bw)的组方剂量进行灌胃,连续灌胃30 d后,每只小鼠腹腔注射2 mL 2%(V∶V)绵羊红细胞(SRBC) 悬液进行免疫4 d。4 d后小鼠颈椎脱臼处死,取出脾脏,于无菌Hank's液研磨,并清洗2次,用RPM1640培养液中制成5×106个/mL小鼠脾细胞悬液。在试管中加入与等量Hank's液混合的培养液0.5 mL,10%的SRBC 50,20 μL小鼠脾细胞悬液(5×106个/mL),迅速混匀后倾倒于玻璃板上的琼脂糖薄层上,每只小鼠铺2个玻璃板,在37℃,5%的CO2培养箱中孵育1.5 h后,加入稀释好的补体溶液于玻璃片架凹槽中,再孵育1.5 h后弃去补体,计空斑数[9]。
1.4 半数溶血值(HC50)测试
按1.3方法对昆明种小鼠连续灌胃各组方30 d后,每只小鼠腹腔注射2 mL 2%(V∶V)绵羊红细
1.5 统计学处理
2 结果与分析
2.1 龟甲人参鹿茸片组方主成分可溶性蛋白质、多糖含量
研究表明,龟甲每日服用2~3 g可以起到增强免疫力的作用。卫生部发布《批准人参(人工种植)为新资源食品的公告(2012年第17号)》,批准种植人参为新资源食品,限定食用量≤3 g/d。因此,设计出3种不同的组方,进行其主成分可溶性蛋白质、多糖含量测定。
各组方的蛋白质及多糖含量见表1。胞(SRBC)悬液进行免疫4 d[10]。4 d后摘眼球取血将采集的全血于37℃下恒温30 min,然后置于4℃冰箱中1 h,在转速2 000 r/min下离心3 min,分离血清。用生理盐水稀释血清200倍。取稀释血清1 mL置于试管内,加入0.5 mL 10%SRBC及1 mL补体,以生理盐水作为对照,置37℃下恒温30 min,冰浴终止反应。以转速2 000 r/min离心3 min,取上清1 mL,加都氏试剂3 mL,于540 nm处测各管的吸光度,同时取0.25 mL 10%SRBC及4 mL都氏试剂于另一试管,混匀放置10 min后于波长540 nm处作为空白对照[10]。半数溶血值(HC50)计算如下:
表1 各组方的蛋白质及多糖含量
由表1可知,龟甲2 g,人参3 g,马鹿茸0.5 g的组方可溶性蛋白质、多糖含量最高,分别为1 159.8,62.0 μg/mL。根据《中华人民共和国药典》中规定,龟甲的质量控制方法为检测其水溶性浸出物。人参的有效成分为检测其所含有的人参皂苷Rg1和人参皂苷Re。另一方面,大量文献报道,人参蛋白质、多糖是人参的重要活性部位。鹿茸的蛋白质、肽类、多糖是其重要活性部位。因此,采用测定水溶性浸出物中蛋白质及多糖含量,可以间接反映出龟甲人参鹿茸片主要功效成分的含量。
2.2 不同组方对昆明种小鼠体液免疫功能的影响
按1.2方法对小鼠连续灌胃各组方30 d后,用Jerne改良玻片法进行抗体生成细胞测定,计算溶血空斑数。
各组方对小鼠溶血空斑数的影响见表2。
表2 各组方对小鼠溶血空斑数的影响 (,n=10)
表2 各组方对小鼠溶血空斑数的影响 (,n=10)
组 方 动物数/只 溶血空斑数/个×10-6脾细胞对照组组方1组方2组方3 10 10 10 10 204.7±41.3 254.6±51.9 319.4±44.5 283.1±46.0
由表2可知,组方2的溶血空斑数最多。溶血空斑数的多少代表着B细胞抗体产生的能力强弱[11]。
抗体生成细胞数和半数溶血值(HC50)体现了体液免疫功能的强度[11]。
龟甲粉对小鼠HC50的影响见表3。
表3 龟甲粉对小鼠HC50的影响 ,n=10)
表3 龟甲粉对小鼠HC50的影响 ,n=10)
组 方 动物数/只 HC50对照组组方1组方2组方3 10 10 10 10 86.9±17.6 106.4±18.7 147.2±23.7 121.8±22.1
由表3可知,组方2的增加小鼠半数溶血值(HC50)最多。表2和表3都表明了组方2对小鼠体液免疫功能增强最多。
由上述结果可知,组方2对昆明种小鼠体液免疫功能促进作用最强,可溶性蛋白质、多糖含量最高。从组方2与组方1和组方3相比,组方2的人参含量最多,组方3的龟甲粉含量最多。因此,组方中人参的量对可溶性蛋白质、多糖含量贡献大于龟甲的量。
3 结论
由龟甲2 g,人参3 g,马鹿茸0.5 g构成的组方2可溶性蛋白质、多糖含量最高,分别为1 159.8,62.0 μg/mL。3种组方中,组方2促进小鼠B细胞抗体产生的能力强,增加小鼠半数溶血值(HC50)最多,对小鼠体液免疫功能增强最多。因此,组方2是龟甲人参鹿茸片组方主成分的合理组成。