生长激素不同刺激方式对肥胖大鼠Janus激酶/信号转导及转录激活因子信号通路的影响▲

罗燕飞 布力布丽·巴哈提 米热古丽·买买提 曹 晨 梁 玲

(新疆医科大学第一附属医院儿科，乌鲁木齐市 830054，电子邮箱：13669905477@163.com)

生长激素是通过腺垂体分泌的一种肽类激素，在人体中具有重要的生理作用，其通过对骨骼、肌肉、肺脏、肝脏和肾脏等器官的调节进而影响人体各个系统生长、发育和代谢[1-2]。生长激素主要通过两种机制作用于人体，而这两种机制都以生长激素与靶细胞膜上的生长激素受体相结合进而激活各自的信号通路。一种机制是与生长激素受体结合后激活Janus激酶(Janus kinase,JAK)/信号转导及转录激活因子(signal transducers and activators of transcription,STAT)信号通路，另一种机制是与生长激素受体结合后激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路[3]。鉴于生长激素对人体的重要性，本研究分析生长激素不同刺激方式对大鼠JAK/STATS信号通路的影响，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取7日龄的健康Wistar大鼠共78只，其中雄性38只、雌性40只，体重(360.52±6.41)g，均来源于新疆医科大学动物实验室，动物生产许可证编号：SCXK(新)2013-0001。用电子天平称其重量，并测量其身长，计算Lee指数(即肥胖评定指数)，Lee指数=[体重(g)]1/3×1000/体长(cm)。实验开始前，4组大鼠的体重、Lee指数比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)，见表1。本研究动物实验已经通过新疆医科大学第一附属医院实验动物伦理委员会批准。

表1 4组大鼠的体重及Lee指数比较(x±s)

1.2 主要实验试剂及仪器 Benchmark Plus全波长自动酶标仪(上海新振仪器设备有限公司)，BP211D型电子分析天平(美国Sartorius公司)，Milli-Q Biocei型超纯水系统(美国Millipore公司)，1-14K型高速低温离心机(德国Sigma公司)，C1000型PCR仪(美国Bio-Rad公司)，DYY-8C型电泳仪(北京六一仪器厂)。D12492超高脂饲料(美国Research Diets公司)，磷酸缓冲盐溶液(美国Invitrogen公司)，重组人生长激素(recombinant human growth hormone,rhGH；长春金赛药业有限责任公司生产，批准文号：S20000001)，RNA提取试剂盒(美国Invitrogen公司)，SYBR Premix Ex TaqⅢ试剂盒(TaKaRa公司生产，DRR041A)。引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.3 肥胖大鼠模型的建立 将大鼠按照增脂饮食饲养1周，饲养条件为无特定病原体级，室温20℃～22℃，自然光线，自由饮水进食7 d后采用D12492超高脂饲料(59.9%脂肪、20%蛋白质、20.1%碳水化合物)喂养4周，使其体重达320～350 g，即模型建立成功。最终共获得60只饮食诱导的肥胖大鼠，建模成功率为76.92%(60/78)。

1.4 分组及干预方法 采用随机数字表法将肥胖模型大鼠分为A、B、C、D组，每组15只，分别给予磷酸缓冲盐溶液2 ml/d、rhGH 0.1 IU/(g·d)、rhGH 0.2 IU/(g·d)、rhGH 0.3 IU/(g·d)肌肉注射，1次/d，同等条件下饲养，2周后处死，其中每组采用随机数字表法选取7只在处死前30 min注射1 IU/g的rhGH。

1.5 标本的获取 10%水合氯醛麻醉大鼠后解剖其腹腔，取出肝脏、肾脏周围和皮下周围的部分脂肪，用滤纸吸去表面的组织液，使用4℃磷酸缓冲液冲洗后保存备用。

1.6 JAK2与STAT5 mRNA表达的检测方法 (1)总RNA提取：称取肝、肾及脂肪组织各50 mg，混合后用于抽提总RNA，液氮预冷后迅速碾压成粉末，加入Trizol试剂使组织充分裂解，室温静置后进行分离(2 500 r/min,-20℃,30 min)；沉淀、漂洗和再溶解，置于-80℃冰箱中保存。(2)RNA浓度及纯度测定：用焦碳酸二乙酯水为空白对照，分光光度计测定读取A260和A280，并计算A260和A280的比值。(3)引物设计：应用Oligo 6.71 Demo软件辅助设计引物，JAK2 上游引物为(5′-3′)GCT CAG TGG CGG CAT GAT，下游引物为CAC TGC CAT CCC AAG ACA TTC；STAT5上游引物为(5′-3′)CCC TTC CCG TGG TTG T，下游引物为(5′-3′)ATG CCG TTG TAG TCC TC；内参c-Myc上游引物为(5′-3′)ATG CCC CTC AAC GTT AGC，下游引物为(5′-3′)AGC TCG CTC TGC TGC TGC。(4)循环参数：① JAK2：反应体系20 μl；变性温度95℃，40 s，退火温度51.3℃，复性时长40 s，循环次数30次。② STAT5：反应体系20 μl；变性温度95℃，40 s，退火温度51.0℃，复性时长40 s，循环次数30次。③ c-Myc：反应体系20 μl；变性温度95℃，40 s，退火温度55.0℃，复性时长40 s，循环次数30次。应用C1000型PCR仪收集各个基因的Ct值。(5)计算相对表达量：使用2-△△Ct法计算基因的相对表达量。

1.7 统计学分析 应用SPSS 21.0软件进行统计分析。计量资料以(x±s)表示，两组间比较采用t检验，多组比较采用方差分析。使用Spearman相关系数进行相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 4组大鼠JAK2 mRNA基因相对表达水平比较 与A组相比，其他3组大鼠的JAK2 mRNA相对表达水平均下降(均P<0.05)；随着rhGH剂量的上升，B、C、D组的JAK2 mRNA相对表达水平下降(r=-0.941，P<0.001)。各组内处死前注射rhGH及未经处理的大鼠间JAK2 mRNA相对表达水平差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表2。

表2 4组大鼠JAK2 mRNA基因相对表达水平比较(x±s)

注：组间两两比较均P<0.05。

2.2 4组大鼠STAT5 mRNA基因表达水平比较 与A组相比，其他3组大鼠的STAT5 mRNA相对表达水平降低(均P<0.05)；且随着rhGH剂量的增加，B、C、D组的STAT5 mRNA相对表达水平降低(rs=-0.956，P<0.001)。各组内处死前注射rhGH及未经处理的大鼠间STAT5 mRNA相对表达水平差异无统计学意义(均P>0.05)。见表3。

表3 4组STAT5 mRNA相对表达水平比较(x±s)

注：组间两两比较均P<0.05。

3 讨 论

JAK/STAT信号通路转导始于生长激素受体与生长激素的相结合，生长激素受体通过二聚体的形式与生长激素结构中的单环结构结合，然后可激活自身与JAK2的磷酸化，磷酸化的JAK2又可以激活生长激素受体，形成交叉磷酸化，二者结合生长激素共同形成生长激素-生长激素受体-JAK2多聚体，为下游信号分子提供结合位点[4-5]。国外研究结果显示JAK/STAT信号通路能够为多种细胞因子提供传导途径，但多种细胞因子也可以抑制JAK/STAT信号通路[6]，其机制已基本清楚，但其如何在传导过程中进行调控及不同浓度生长激素长期刺激机体是否会对JAK/STAT信号通路产生影响有待于继续研究。

王娟等[7]发现小鼠处死前注射单剂量生长激素的小鼠肝细胞核磷酸化STAT水平及STAT5 DNA的黏附活性均是长期连续注射生长激素小鼠的2倍，说明rhGH慢性刺激抑制了小鼠JAK/STAT信号转导通路。本研究结果显示，经注射rhGH 2周的肥胖小鼠的JAK2及STAT5 mRNA相对表达水平均低于未注射rhGH的A组(均P<0.05)，提示长期给肥胖小鼠注射生长激素可明显抑制STATS的激活，进而可抑制JAK/STAT信号通路，这可能是由于长期注射生长激素致使机体细胞因子信号抑制物3基因转录表达增加，从而调控性抑制JAK-STAT信号通路。此外，本研究结果还显示，随着rhGH剂量的增加，肥胖大鼠的JAK及STAT5 mRNA相对表达水平呈下降趋势(P<0.05)，提示在一定范围内，rhGH注射剂量越大对JAK/STAT信号通路的抑制越明显。

本研究采用短时间刺激和长期刺激两种方式对肥胖大鼠注射rhGH，发现在肥胖小鼠机体正常分泌生长激素情况下，长期注射rhGH可抑制肥胖小鼠JAK/STATS的基因表达水平，但各组内处死前注射rhGH及未经处理的大鼠间JAK2及STAT5 mRNA相对表达水平差异均无统计学意义(均P>0.05)，提示短时注射高剂量rhGH对于肥胖小鼠的JAK及STAT5 mRNA表达无明显影响，可能是长期注射rhGH降低了机体对处死前注射rhGH刺激的敏感性。如果将处死前注射rhGH视为机体分泌生长激素的峰值，则进行长期注射rhGH刺激或许能够抑制机体对内源性生长激素的敏感程度，提示长期注射rhGH能够抑制JAK/STAT信号通路，并使机体对GH敏感性降低，国内相关研究中也得出相似的结论[8-9]。因此，我们认为生长激素不同的刺激方式对JAK/STATS信号通路会造成不同程度的影响，关于其各自的相关机制和作用位点有待于进一步探讨。

综上所述， rhCH慢性刺激可抑制小鼠肝细胞的JAK/STAT5信号转导通路，且随着刺激剂量的提高其抑制作用有上升趋势，但在此基础上快速rhCH刺激则无显著作用。