响应面分析法优化广西北部湾南美白对虾虾头酶解工艺

，，,3，*

(1.钦州学院，广西 钦州 535099；2.广西大学，南宁 530004；3.广西北部湾特色海产品资源开发与高值化利用高校重点实验室，广西 钦州 535099)

南美白对虾(Penaeusvannamei)学名凡纳缤对虾[1]，在我国广东、广西、海南等省产业带迅猛发展，在“十一五”期间，在北海、钦州、防城港三市已形成南美白对虾养殖优势产业带。我国对虾市场近年容量可达200万吨[2]，对虾加工一般是去头或去壳[3]，将产生诸多虾废弃物[4]，科学地利用虾头资源、提高其经济价值是一种发展趋势。张爱军等[5]和Ifuku[6]利用虾废弃物制备甲壳素；Coward-Kelly等[7]利用虾废弃物制成饲料；Sánchez-Camargo等[8]利用虾废弃物提取虾青素等；Robertoe等[9]和Amado等[10]利用虾副产物提取虾青素蛋白；但广西虾头利用的研究报道较少且未见对酶种进行筛选后优化的报道。酶法是绿色环保技术，是具有一定催化活性位点的蛋白酶作用于蛋白质的肽键发生水解，使蛋白质断裂成低分子量多肽[11,12]。故本试验研究了最适酶种，根据Box-Behnken中心组合试验确定最优酶解工艺条件并建立模型，为制备风味良好的南美白对虾虾头调味料基料，打开广西对虾加工产生的大量废弃物深利用的局面，增加广西对虾的经济价值奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

南美白对虾：广西钦州市东风市场；木瓜蛋白酶(6×104U/g)、碱性蛋白酶(2×105U/g)、中性蛋白酶(2×105U/g)：南宁东恒华道生物科技有限责任公司；甲醛：上海化学试剂采购供应站经销。

101-3型电热鼓风恒温干燥箱 上海东星建材试验设备有限公司；HH-4型数显恒温水浴锅 金坛市科析仪器有限公司；EL204型电子天平 上海光谱仪器有限公司；EL20实验室pH计 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 南美白对虾虾头酶解工艺

虾头→清洗→晾干→打浆→加水混合→调pH、加酶→恒温水解→灭酶→离心→酶解液。

1.2.2 测定方法

水分的测定：直接干燥法[13]；灰分的测定：高温灼烧法[14]；粗脂肪的测定：索氏提取法[15]；蛋白质含量的测定：半微量凯氏定氮法[16]。

游离氨基氮的测定：甲醛电位滴定法[17]；将离心的酶解液加入到烧杯中，备用。加入10 mL中性甲醛，搅匀，静置2 min，用0.5 mol/L的NaOH标准滴定溶液滴定至pH 9.2；并记录消耗的0.5 mol/L NaOH标准液的毫升数V1。用相同体积蒸馏水重复上述操作进行空白测试。

游离氨基氮(mg/mL)=C×(V1-V2)×14/V。

公式(1)

式中：C为NaOH标准滴定液浓度；V1为消耗的标准滴定液的毫升数；V2为空白测试消耗标准滴定液的毫升数；V为上清液体积，mL。

蛋白质水解度(DH)=(离心所得氨基氮的质量)/样品中总氮质量×100%[18]。

公式(2)

1.2.3 酶的筛选

选取木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶3种蛋白酶为实验酶，根据选择的蛋白酶的特性[19]和姜震、高翔等研究报道的蛋白酶的最适水解条件[20,21]，在酶活力相当的基础上，分别用3种蛋白酶对南美白对虾虾头进行酶解，酶解条件见表1。

表1 酶种酶解条件Table 1 Enzyme hydrolysis conditions

1.2.4 单因素试验

采用1.2.1的工艺进行酶解单因素试验，取虾头浆5.0 g，按加酶量0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%，料液比1∶2，温度50 ℃，反应时间2 h，pH 7.0，考察加酶量对虾头水解度的影响；取虾头浆5.0 g，按料液比1∶2，加酶量0.8%，pH 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，温度50 ℃，反应时间2 h，考察pH对虾头水解度的影响；取虾头浆5.0 g，按料液比1∶2，加酶量0.8%，温度50 ℃，pH 7.0，分别反应1，2，3，4，5 h，考察酶解时间对虾头水解度的影响；取虾头浆5.0 g，按料液比1∶2，加酶量0.8%，pH 7.0，分别在30，40，50，60，70 ℃保温2 h，考察酶解温度对虾头水解度的影响。

1.2.5 Box-Behnken中心组合试验

在单因素基础上，根据Box-Behnken中心组合试验设计原理[22]，以水解度为指标，进行响应面试验设计，见表2。

表2 响应面设计表Table 2 Response surface design table

1.2.6 数据处理

用Design-Expert 8.0.5b软件和Origin 8.0软件处理试验所得数据。

2 结果与分析

2.1 南美白对虾虾头营养成分

表3 虾头营养成分Table 3 Nutritional components of shrimp head %

由表3可知，广西北部湾地区南美白对虾虾头营养成分依次为水分>粗蛋白>灰分>粗脂肪，虾头营养丰富，尤其是粗蛋白含量高达6.92%+0.01%，与张祥刚等[23]研究的阳江市谊林海达速冻水产有限公司提供的虾头营养成分相一致，其蛋白含量略高于广西南美白对虾，可能是地域、养殖方式和喂养方式不同等因素导致营养成分出现差异[24]。故充分利用虾头中的蛋白质，变废为宝，提高虾头利用率[25]。

2.2 酶的筛选

图1 酶种对水解度的影响Fig.1 Effect of enzyme species on the degree of hydrolysis

由图1可知，在最佳酶解条件下，酶种对南美白对虾虾头酶解有显著影响。其酶解大小依次为碱性蛋白酶>中性蛋白酶>木瓜蛋白酶。相比中性蛋白酶，碱性蛋白酶的酶解能力提高了30%，而对于木瓜蛋白酶，碱性蛋白酶的酶解能力提高了5%。可能是碱性蛋白酶为内切酶，属于一种丝氨酸脆外高碱性蛋白酶，它能水解蛋白质分子肽链生产多肽或氨基酸，具有较强的分解蛋白质的能力[26]，比其他蛋白酶对南美白对虾的酶解作用强。因此，确定了本试验最佳蛋白酶是碱性蛋白酶。与姜震等采用酶解法提取龙虾废弃物中蛋白质所选的酶解蛋白酶相一致。

2.3 加酶量对水解度的影响

由图2可知，随着碱性蛋白酶用量不断增加，水解度有显著升高，加酶量达0.8%时，水解度达到最高，为38.07%，随着加酶量增多，水解度降低。从酶促动力学的角度看，当酶用量加到一定值后会发生酶抑制作用，故水解度不会继续升高。因此，选取加酶量为0.8%。

图2 加酶量对水解度的影响Fig.2 Effect of the additive amount of enzyme on the degree of hydrolysis

2.4 pH对水解度的影响

图3 pH对水解度的影响Fig.3 Effect of pH on the degree of hydrolysis

由图3可知pH对虾头水解度的影响，pH达到8.0前，水解度随pH增大而增大，pH 8.0时水解度达到最高，为38.38%，相比于起始pH 5.0，水解度提升了17%。之后随pH值增高，水解度下降，可能是碱性蛋白酶最佳pH为8.0左右，此时有利于碱性蛋白酶对虾头蛋白进行水解，导致氨基氮含量有所变化。

2.5 时间对水解度的影响

由图4可知，在1～3 h之间，随着酶解时间增加，酶解效果越来越好，水解度逐渐增高。继续延长酶解时间，水解度先下降然后趋于平稳，可能是随着时间的增长，即加热时间增长导致酶可能失活，酶活力下降。因此，选择水解度最高的3 h。

图4 时间对水解度的影响Fig.4 Effect of time on the degree of hydrolysis

2.6 温度对水解度的影响

图5 温度对水解度的影响Fig.5 Effect of temperature on the degree of hydrolysis

由图5可知，在选定的温度范围内，随着温度的升高，水解度也有显著的增加，但在50 ℃以后，水解度开始降低，原因可能是加热温度过高使碱性蛋白酶失活，会抑制酶解反应的速率，导致水解度降低[27]。因此，选取温度为50 ℃。

2.7 响应面优化试验结果

为获取风味好、水解率高的南美白对虾蛋白酶解产物，在碱性蛋白酶水解单因素试验的基础上，利用响应面优化法进行最适水解条件的优化，响应面试验数据见表4。

表4响应面试验结果
Table 4 The results of response surface test

试验号A加酶量(%)B pHC时间(h)D温度(℃)水解度(%)11.07.03.05039.9720.88.04.06039.2330.88.03.05042.9641.08.04.05041.2951.08.03.06040.0860.88.03.05042.6270.87.04.05039.99

续 表

2.8 回归方程拟合及方差分析

采用Design-Expert 8.05b软件对表4的27组试验数据根据方程进行多元回归分析，建立响应面回归模型，得到水解度(DH)对编码自变量A，B，C，D的标准回归方程为：

方程1：DH=42.67+0.68A+0.67B+2.51C+4.23D+0.11AB-0.097AC-0.42AD-1.25BC-1.19BD-0.81CD-1.34A2-2.63B2-3.02C2-5.60D2。

转化为实际空间的方程为：

方程2：DH=-446.58375+64.67917A+51.97583B+35.03167C+7.38133D+0.53750AB-0.48750AC-0.21125AD-1.25000BC-0.11875BD-0.080750CD-33.47917A2-2.62792B2-3.01542C2-0.055967D2。

方程3：DH=-446.58375+64.67917A+51.97583B+35.03167C+7.38133D-1.25000BC-0.11875BD-33.47917A2-2.62792B2-3.01542C2-0.055967D2。

表5 回归模型方差分析Table 5 Regression model and analysis of variance

注：p值<0.0001时表示极显著，p值<0.0500时表示显著；“**”表示极显著，“*”表示显著。

2.9 响应面图分析

(a)加酶量与pH

(b) 加酶量与时间

(c) 加酶量与温度

(d) pH与时间

(e)pH与温度

(f) 时间与温度

响应曲面的分析主要是从响应面曲线图及等高线进行分析。由图6中(a)可知，当时间为3 h时，酶解温度为50 ℃，加酶量相对较少时，随着pH值的升高，水解度增加效果只有微少变化；而当加酶量逐渐升高时，pH在零水平下的水解效果更好。由于单因素对响应面的影响是显著的，当加酶量和pH值在接近零水平时，即加酶量在0.8%和pH值在7.8～8.2之间时，水解度出现最高点。由图6中(b)可知，当pH值为8.0时，酶解温度为50 ℃，在设定的范围内，虾头水解度随加酶量的增加而升高，同理，水解度也随时间的延长在一定程度上升高。前期的试验也证明，当加酶量和时间在接近零水平时，即加酶量为0.8%和酶解时间为3 h左右，水解度出现最高点。当pH值为8.0，时间为3 h，由于单因素对响应面影响显著，在设定范围内，水解度随着加酶量的增加和温度的提高而有一定的升高，当加酶量和温度在接近零水平时，即加酶量为0.8%和温度为50 ℃时，水解度出现最高值。当加酶量为0.8%，酶解温度为50 ℃，pH值和时间以及它们的相互作用对水解度的影响都是显著的，因为等高线的形状反映交互效应的强弱大小，越趋向于椭圆形以及相应曲面越陡峭表示两因素交互作用显著。pH值和时间在接近零水平，即当pH为8.0和酶解时间为3 h左右时，水解度出现最高值。由图6中(e)可知，当加酶量为0.8%，酶解时间为3 h，pH和温度以及它们之间的交互作用对响应面的影响都是显著的，因为等高线的形状反映交互效应的强弱大小，越趋向于椭圆形以及相应曲面越陡峭表示两因素的交互作用显著。因此，这2个因素接近零水平时，即pH接近8.0、酶解温度接近50 ℃时，水解度出现最高值。由图6中(f)可知，当加酶量为0.8%，pH为8.0时，由于时间和温度这2个因素的一次项和二次项对响应面都有显著的影响，在一定范围内，水解度会随着时间和温度的升高而升高，时间和温度在接近零水平时，即酶解时间为3 h和酶解温度为50 ℃时，水解度出现最高值。响应面分析也说明我们确定的最佳加酶量、pH值、酶解时间和酶解温度都在设定的试验范围内。

3 验证试验

通过中心组合设计优化和对拟合模型方程的分析，获得了拟合方程的最大值点，即加酶量0.84%、pH 7.96、时间3.37 h、酶解温度53 ℃。为考察该点和实际值的差异，特别是在pH<8.00这样一种超出考察范围的条件下的拟合度，需要在该条件下，进行酶解南美白对虾虾头验证试验。验证试验除所求的4个条件不一样之外，其余条件，包括设备和设计响应面的酶解试验均相同。试验3次平行所测得的水解度为43.85%，43.88%，43.91%，这与43.92%的预测值存在可接受的误差，故取平均值为43.88%±0.03%，在本试验中，在试验考察范围之外的该点处，方程失去了较少的拟合度，该方程比较理想，最优组合较可靠。

4 结论

广西北部湾地区南美白对虾虾头营养丰富，尤其是蛋白含量较高；通过响应面法对虾头进行酶解工艺优化，建立了虾头蛋白水解度的回归模型为DH=-446.58375+64.67917A+51.97583B+35.03167C+7.38133D-1.25000BC-0.11875BD-33.47917A2-2.62792B2-3.01542C2-0.055967D2。优化所得最佳条件为加酶量0.84%、pH 7.96、时间3.37 h、酶解温度53 ℃，在此条件下，水解度为43.88%±0.03%。为广西北部湾南美白对虾下脚料利用提供了数据， 可获得风味良好的虾调味料基液。