酿造酱油储藏期间呈味分子变化研究

2019-04-11，，，*

中国调味品 2019年4期

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(1.华南理工大学食品科学与工程学院，广州 510641；2.中新国际联合研究院，广州知识城，广州 510555；3.海天调味食品股份有限公司，广东佛山 528000)

中国酱油历史源远流长，由于我国幅员辽阔、人们生活习惯不同，国内酱油工业所用原料、生产工艺、产品品质因地区不同有很大差异。按照制作方法的不同可分为酿造酱油和配制酱油。酿造酱油是指以大豆或脱脂大豆、小麦或麸皮为原料，经微生物发酵而制成的具有特殊色、香、味的液体调味品。配制酱油是指以酿造酱油为主体，与酸水解植物蛋白调味液、食品添加剂等配制而成的液体调味品[1]。在酱油的色、香、味、体态等感官指标中，风味是最直观、最受消费者关注的指标，随储藏时间的延长，酱油易出现不可逆的口感逐渐变苦的情况，导致酱油的风味物质被掩蔽、营养价值降低，显著影响了酱油储藏期间的稳定性[2]。因此，对于酿造酱油储藏期间呈味分子变化的研究已成为调味品行业中亟待解决的问题。

酱油成分复杂，主要包括以大豆为主的蛋白质原料水解后产生的肽、游离氨基酸，以小麦为主的淀粉质原料水解后产生的糖类，还含有植物水解后的天然活性物质如单宁、黄酮、酚酸等。由于地域和天气条件不同，南北方的酱油虽都是以发酵为主，但制作工艺有所差别，风味也各有特色，南方酱油口味偏甜而北方酱油口味偏咸[3]。本研究选取两种不同地域较有代表性的高盐稀态法酿造酱油为研究对象，从酱油体系中不同化合物分子之间的氧化分解、分子聚集等角度入手，研究酱油在储藏期间呈味分子的变化，探讨影响酱油品质稳定性的原因，以期为酱油生产储藏提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

市售高盐稀态法酿造酱油(酱油Ⅰ、酱油Ⅱ)，购自广州；细胞色素C(12,384 Da)、抑肽酶(6,511 Da)、杆菌肽(1450 Da)、Gly-Gly-Tyr-Arg(451 Da)、Gly-Gly-Gly(189 Da)，购自Sigma公司；色谱级甲醇、钨酸钠、钼酸钠、硫酸锂、碳酸钠、没食子酸、三氯乙酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、磷酸、浓盐酸、溴水，均为分析纯。

1.2 主要仪器设备

L-8900高速氨基酸分析仪株式会社日立制作所；AKTA蛋白纯化仪，SuperdexTMPeptide 10/300 GL色谱柱通用电气公司医疗集团；BSA124S万分之一电子天平德国赛多利斯集团；H2050R高速离心机湘仪动力测试仪器有限公司；UV754N紫外分光光度计上海仪电有限公司；THZ-82A恒温振荡器常州溪华仪器有限公司；KDN-1型自动凯氏定氮仪上海科晓科学仪器有限公司；DHG-9070A电热恒温鼓风干燥箱上海培因实验仪器有限公司；PHS-3C数显台式酸度计上海浦春计量仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 常温和加速储藏试验

酱油一般保质期为1～2年，为缩短考察时间，可在加速储藏条件下进行稳定性试验，考察样品在储藏期间呈味分子的变化。参考国家食品药品监管总局办公厅印发的《保健食品稳定性试验指导原则》，将两种不同品牌的市售酱油(酱油Ⅰ、酱油Ⅱ)分别在常温和高温下储藏，参考相关文献[4,5]，将加速储藏条件设置为50 ℃、60% RH。分别测定不同储藏条件和储藏时间下酱油呈味分子的变化情况。

1.3.2 酱油单宁和游离酚含量的测定

取分别在常温、50 ℃下储藏0，5，10，15，20天的两种酱油，参考NY/T 1600—2008、LS/T 6119—2017并作适当修改，测量其单宁和游离酚含量。

1.3.3 酱油氨基酸组成及含量的测定

取分别在50 ℃下储藏0，20天的两种酱油各50 μL，并稀释至原体积的50～100倍，再以4%的三氯乙酸溶液稀释10倍，10000 r/min离心15 min，上清液经0.22 μm微孔膜过滤后备用。

以氨基酸分析仪检测样品的氨基酸组成情况。检测条件：色谱柱为磺酸性阳离子交换色谱柱(60 mm×4.6 mm，3 μm)；分离柱柱温57 ℃，反应柱柱温135 ℃，进样量20 μL，流速0.5 mL/min，检测限为3 pmol。

1.3.4 酱油多肽分子量分布的测定

取分别在50 ℃下储藏0，15，30天的两种酱油各50 μL，并用0.02 mol/L PBS缓冲液稀释至蛋白浓度为5 mg/mL，经0.22 μm微孔膜过滤后备用。蛋白质含量的测定参考GB 5009.5—2010。

色谱检测条件参考卢韵君等人的方法并做适当修改，检测波长为214 nm，流速为0.5 mL/min，单次进样量为500 μL，单次分析时间为80 min[6]。根据标准曲线，通过面积归一化法计算各样品多肽分子量分布。

1.3.5 数据分析

测定结果以P<0.05为显著性评定指标，数据用x±SD表示，采用Graph Prism和Origin制图。

2 结果与分析

2.1 酱油储藏期间单宁和游离酚含量的变化

单宁是一类水溶性、分子量在500～3000 Da之间的酚类化合物，在植物界中广泛分布，是一种重要的次级代谢产物，也是除木质素以外含量最多的一类植物酚类物质。单宁可与唾液中的蛋白质发生化学反应，使口腔表层产生一种收敛性的触感，人们通常形容为“涩”。单宁的含量与苦涩程度成正比，直接影响到酱油产品的风味。

没食子酸标准曲线方程为y=0.117x+0.0222，R2=0.9994。根据此标准曲线可求出不同样品中的单宁、游离酚含量，见图1和图2。

图1 酱油I、Ⅱ在常温(a)、50 ℃(b)储藏后单宁含量变化Fig.1 The change of tannin content of soy sauce I and Ⅱ at normal temperature (a) and 50 ℃ (b)

由图1可知，酱油Ⅰ和酱油Ⅱ的初始单宁含量有显著性差异(P<0.05)，这与两种品牌酱油的原料、生产工艺等密切相关。随着储藏时间的推移，两种酱油中的单宁含量呈现上下波动的趋势。但酱油Ⅰ的单宁含量波动较为剧烈，第5天的单宁含量与其余各时间均具有显著性差异。而不同储藏时间下酱油Ⅱ的单宁含量无显著性变化。酱油中的小分子物质黄烷-3-醇可发生聚合反应生成单宁，同时单宁在酸性条件下可发生水解作用[7]。水解作用与聚合反应的同时存在，表现为酱油中单宁含量在一定范围内出现上下波动的现象。

根据存在形态的不同，多酚分为游离态多酚和结合态多酚[8]。游离态多酚是以单体形式被物理吸附或截留于食品基质中的多酚，易溶于水或有机溶剂。结合态多酚是经由共价键与食品基质(如细胞壁物质)相结合的多酚，具有难萃取的特点。结合态多酚在酸、碱、酶等的作用下可发生水解反应，而导致多酚的流失。其中，酸水解反应主要通过破坏糖苷键来释放结合态多酚，但不能释放通过酯键结合的多酚，但是酸水解往往需要较高的温度。粮谷类食品中的结合态多酚主要包括阿魏酸、香豆酸、羟基肉桂酸、可水解单宁等与多糖类物质共价结合的酚酸类物质[9]。目前关于酚类物质对食品品质影响的研究不尽一致，酱油体系复杂，多酚的含量在一定程度上决定了其抗氧化功能的强弱，但同时多酚又是苦涩味的来源之一。

图2 酱油I、Ⅱ在常温(a)、50 ℃(b)储藏后游离酚含量变化Fig.2 The change of free phenol content of soy sauce I and Ⅱ at normal temperature (a) and 50 ℃ (b)

由图2可知，酱油Ⅰ与酱油Ⅱ的初始游离酚含量有显著性差异(P<0.05)，随着储藏时间的推移，两种酱油中的游离酚含量在一定范围内呈现不规则波动，但差异并不明显。这种变化趋势的产生与储藏条件并无太大关系。据研究，酱油体系为酸性环境，在加热条件下游离酚含量会显著增加，这是由于酚酯热分解所致[10]。未灭菌的酱油在80 ℃条件下加热10 h后，其游离酚成分的含量会达到最高。同时，游离酚还是酶促褐变的底物，在多酚氧化酶的作用下可被氧化生成醌类物质，醌类物质聚合生成黑色素，导致酱油在储藏期间苦味加重、色泽变深。酸水解与酶促褐变同时存在，造成了酱油中游离酚含量的上下波动。

2.2 酱油储藏期间氨基酸组成及含量的变化

氨基酸组成及含量在一定程度上影响着酱油的品质。通常来说，酱油品质鉴定各项指标中风味是最重要的，在酱油呈味体系中，以鲜味为主，其次是甜味和苦味。通过对50 ℃下储藏0，20天的酱油Ⅰ和酱油Ⅱ的氨基酸组成进行测定，得出17种常见氨基酸的含量，见表1。结果表明，两种品牌酱油的氨基酸组成基本一致，但含量各有不同。

谷氨酸是一种酸性氨基酸，是酱油中的主要鲜味物质。酱油中的谷氨酸主要来源于原料的蛋白质，除了赋予酱油鲜美的味道外，还作为蛋白质的一种成分被人体所吸收利用。酱油Ⅱ比酱油Ⅰ有更高的谷氨酸含量，且储藏20天后，酱油Ⅰ和酱油Ⅱ中谷氨酸的含量都有所下降，这使得酱油鲜味有所消退。在酱油新产品的开发中，鲜味酱油、固体酱油、忌盐酱油等都额外添加了一定量的谷氨酸，这样既增强了产品的鲜味，又增加了营养物质。谷氨酸作为特征氨基酸，可作为初步判断产品是否添加鲜味剂谷氨酸钠的依据，如果酱油中谷氨酸占总氨基酸的比例超过30%，可初步认定产品添加了谷氨酸钠[11]。酱油Ⅰ的谷氨酸百分含量为65.32%，酱油Ⅱ的谷氨酸百分含量为80.05%，说明两种酱油在制作过程中都人工添加了谷氨酸钠以提高鲜味。除谷氨酸与未检出的丙氨酸及半胱氨酸外，相同储藏时间下酱油Ⅰ中其他各种氨基酸的含量均比酱油Ⅱ高。除谷氨酸外，天冬氨酸也是鲜味的主要来源。谷氨酸-天冬氨酸、谷氨酸-丝氨酸和在酿造过程中生成的一些低级肽也具有鲜味[12]。酱油Ⅰ中天冬氨酸、丝氨酸含量较高，酱油Ⅱ中谷氨酸含量较高，总体作用使得两种酱油鲜味相当。

表1 酱油I、Ⅱ储藏前后氨基酸组成及含量变化Table 1 The amino acid composition and content of soy sauceⅠ and Ⅱ before and after storage g/dL

注：“—”表示未检出，同行不同肩标小写字母表示差异显著(P<0.05)。

酱油在酿造过程中产生的甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸和脯氨酸对酱油甜味有重要作用[13]，总体来说，酱油Ⅰ呈甜味的氨基酸含量比酱油Ⅱ高，且50 ℃储藏20天对甜味氨基酸含量几乎无影响。

酱油中缬氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、精氨酸是使酱油呈苦味的重要来源。酱油中适量苦味物质的存在使得酱油的口感醇厚绵长，但好的酱油不应该有明显苦味。50 ℃储藏20天后酱油Ⅰ中缬氨酸、精氨酸的含量上升，蛋氨酸含量下降，异亮氨酸和苯丙氨酸基本不变；酱油Ⅱ中缬氨酸含量上升，蛋氨酸含量下降，异亮氨酸、苯丙氨酸和精氨酸基本不变。

酱油在储藏期间，鲜味氨基酸含量的下降和苦味氨基酸含量的上升，是导致其风味发生不可逆变化的原因之一。

2.3 酱油储藏期间多肽分子量分布的变化

美拉德反应是食品加工过程中广泛存在的一种非酶褐变反应，主要是指羰基化合物(还原糖)与氨基化合物(氨基酸、肽和蛋白质)经过分子聚合、Amiadori重排、Strecker裂解等一系列反应最终形成类黑精的复杂反应，该反应可生成大量的挥发性化合物和大分子量的聚合物。由于肽的结构和组成较为复杂，且在高温条件下易发生裂解或聚合，尤其是在美拉德反应中，多肽除自身会发生热降解外，还与还原糖类发生羰氨缩合反应，甚至会与中间产物分子发生反应，进而改变其分子结构。

据研究，分子量>10000 Da，5000～1000 Da的肽热降解反应剧烈，美拉德反应体系中此段组分增多可能是由于小分子肽与木糖或其衍生物的缩合所导致的，反应体系中分子量<1000 Da的组分急剧减少，证明其具有良好的美拉德反应活性[14]。同时，刘平等发现在美拉德反应中，还原糖对肽的降解和交联起促进作用，随着反应时间的延长，>5000 Da的肽段含量增加，糖肽交联作用明显，而1000～5000 Da的肽段在反应1 h时增加3.86%，随后缓慢降低[15]。根据相关报道[16,17]，分子量>6000 Da的肽没有苦味。邓勇等研究了大豆多肽分子质量与苦味之间的关系，发现分子质量在500～1000 Da之间的大豆多肽苦味最强[18]。葛文静等利用SEC-HPLC，RP-HPLC对大豆酶解物进行分离纯化，经感官评价和仪器辅助评价，发现疏水性苦味肽是苦味的重要来源，大豆苦味肽分子量集中在200～5000 Da，其中以200～2000 Da的组分的苦味最重[19]。

由图3(a)可知，利用凝胶色谱法对一系列已知分子量的标准品进行检测，通过保留时间与标准品分子量常用对数值(log10)做标准曲线，以保留时间为纵坐标，标准品分子量为横坐标，通过最小二乘法算出线性相关方程，可以获得保留时间与分子量的关系，作为样品分子量定性标准。由图3(b)可知，标准曲线方程为y=94.762-16.964lg(x)，R2=0.9603。同时对分别在50 ℃下储藏0，15，30天的酱油Ⅰ、酱油Ⅱ进行检测。由图3(c)和(d)可知，两种酱油储藏后在30～40 min处峰值变化最明显，表现为该分子量肽段的占比增加，尤其是储藏30天的酱油Ⅰ在20 min处出现明显的大分子聚集。

图3 标准品分子量色谱图(a)、标准曲线(b)酱油Ⅰ(c)与酱油Ⅱ(d)储藏后肽分子量分布的变化趋势Fig.3 Standard molecular weight chromatogram (a)，standard curve (b), molecular weight distribution of peptides in soy sauce I (c) and soy sauce II (d) after storage

对图3(c)和(d)进行积分，由面积归一化法算出各分子量肽段所占比例，见图4。

图4 酱油Ⅰ(a)与酱油Ⅱ(b)储藏期间各分子段肽占比Fig.4 Percentage of peptide molecular weight in soy sauce Ⅰ (a) and soy sauce II (b) during storage period

由图4(a)可知，酱油Ⅰ在储藏15天后，各分子段占比发生明显变化，具体表现为：分子量<200 Da的小分子肽占比减少，2000～5000 Da分子段占比显著增加。继续储藏至30天时，200～2000 Da和2000～5000 Da肽段占比略有下降，而<200 Da和>5000 Da的肽段占比略有上升。由图4(b)可知，随着储藏时间推移，酱油Ⅱ中分子量<200 Da和200～2000 Da的肽段占比略有减少，2000～5000 Da和>5000 Da的肽段占比略有上升，但总体变化趋势相对缓慢。该实验结果与刘平等人的研究结论一致。因此，酱油在储藏期间，不同分子量肽的变化可能导致其风味发生不可逆变化。

2.4 环境条件的改变加速呈味分子的变化

外界环境的改变也可能加速各种呈味分子的变化，最终影响酱油品质的稳定性。例如，温度升高可以使美拉德反应加剧，氧气的引入可促使酚类底物在多酚氧化酶的作用下发生酶促褐变，表现为“黑色素”的生成及酱油变苦、色泽变深。光的光化作用可能促进淀粉糖化、酒精发酵、蛋白质降解、风味物质形成和美拉德褐变等生化反应的进行，或影响微生物的繁殖代谢。也有研究指出光照本身对酱油品质没有直接的影响，但光照可以引起发酵基质的温度升高，从而使酱醪和酱油中各种生理生化反应加快，最终导致酱油品质的差异[20]。