超声辅助双水相提取油菜籽粕黄酮及抗氧化性研究

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(1.陕西理工大学 陕西省催化基础与应用重点实验室，陕西 汉中 723000；2.陕西理工大学 化学与环境科学学院，陕西 汉中 723000)

油菜(BrassicacampestrisL.)，又名油白菜，是十字花科芸薹属植物。油菜籽在生产加工过程中会产生约55%的油菜籽粕，然而，油菜籽粕利用率较低，大部分用于肥料、饲料或者废弃物垃圾等[1]。油菜籽粕富含蛋白质、多酚、硫代葡萄糖苷、原花青素等活性成分[2-4]，尚未得到合理的开发。

黄酮作为一种重要的植物次生代谢产物，广泛应用于食品、医药等行业[5]，其提取方法有溶剂法、超声辅助法、微波辅助法、酶解辅助法、亚临界水提法[6-10]等，其中超声辅助法具有成本低、提取效率高、操作简单、技术可靠等优点[11]。双水相萃取技术作为一种新型的黄酮分离技术，依据组分在上下相间的选择性分配实现有效成分的分离，具有操作条件温和、提取时间短、被分离物质纯度高等优点[12]。关于油菜籽粕中黄酮或多酚的文献报道较多[13]，但未见超声辅助乙醇-硫酸铵双水相提取油菜籽粕中黄酮的研究。因此，本文采取超声辅助乙醇-硫酸铵双水相法对油菜籽粕中的黄酮进行工艺优化，并进一步评价其抗氧化活性，旨在为油菜加工副产品的进一步开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

芦丁标准品：购于南京奥多福尼生物科技有限公司；邻苯三酚、邻二氮菲、硫酸亚铁、抗坏血酸、三羟甲基氨基甲烷(Tris)：购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他试剂均为国产分析纯，实验用水为超纯水。

1.2 主要仪器

Cary50紫外可见分光光度计 美国瓦里安(中国)有限公司；JXL-2S-6A数显恒温水浴锅 浙江省金坛市金祥龙电子有限公司；EL104型电子分析天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；DHG-9070A电热鼓风恒温干燥箱 上海齐欣科学仪器有限责任公司；SB-4200DTD型超声波清洗器 北京新芝生物科技股份有限公司；800型离心机 上海手术机械厂；SHB-Ⅲ循环水式真空泵 长城科工贸有限公司；FW100高速万能粉碎机 天津泰斯特仪器有限公司。

1.3 样品制备及黄酮含量的测定

油菜籽粕：购于陕西省汉中市汉台区菜市场；市购油菜籽粕置于60 ℃恒温干燥箱中烘干，多功能粉碎机中打磨粉碎，过80 目筛，筛滤3遍。正己烷中浸泡脱脂脱色，烘干至恒重，密封备用。

准确称取已处理的油菜籽粕2.0000 g，按照一定的料液比加入不同浓度的乙醇水溶液和适量的硫酸铵，在一定温度、功率的超声波清洗器中提取一定时间，然后减压抽滤，收集滤液至分液漏斗中，静置、分层，收集上层提取液于锥形瓶中。准确移取一定体积的黄酮提取液于50 mL容量瓶中，根据芦丁标准曲线绘制方法测定油菜籽粕提取液中的黄酮浓度，由下式计算超声辅助双水相提取油菜籽粕黄酮的提取量：

黄酮提取量(mg/g) = C×V×N/M。

式中：C为黄酮浓度(mg/mL)；V为提取液体积(mL)；N为稀释倍数；M为称取油菜籽粕粉末的质量(g)。

1.4 绘制芦丁标准曲线

依据文献[14]稍作修改。准确配制0.200 mg/mL的芦丁标准液，依次吸取4.0，6.0，8.0，10.0，12.0，14.0，16.0，18.0，20.0 mL标准液于50 mL容量瓶中，加入0.7 mL 5% NaNO2溶液，摇匀，放置5 min；然后加入10% Al(NO3)3溶液0.7 mL，摇匀，放置5 min；颜色不再变后加入5 mL 4%的NaOH，最后用30%的乙醇溶液定容至刻度线，摇匀，10 min后以30%的乙醇溶液做参比，在波长为510 nm处测定吸光度。以芦丁样品液浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，得到线性回归方程为：y=18.074x+0.1719，R2=0.9993。

1.5 单因素试验

1.5.1 乙醇浓度的选择

固定硫酸铵用量0.2 g/mL，提取温度50 ℃，提取时间30 min，料液比1∶30(g/mL)，超声功率240 W，考察乙醇浓度为20%，30%，40%，50%，60%时油菜籽粕黄酮的提取量。

1.5.2 硫酸铵用量的选择

固定乙醇浓度40%，提取温度50 ℃，提取时间30 min，料液比1∶30(g/mL)，超声功率240 W，考察硫酸铵用量为0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 g/mL时油菜籽粕黄酮的提取量。

1.5.3 提取温度的选择

固定硫酸铵用量0.2 g/mL，乙醇浓度40%，提取时间30 min，料液比1∶30(g/mL)，超声功率240 W，考察提取温度30，40，50，60，70 ℃时油菜籽粕黄酮的提取量。

1.5.4 提取时间的选择

固定硫酸铵用量0.2 g/mL，乙醇浓度40%，提取温度50 ℃，料液比1∶30(g/mL)，超声功率240 W，考察提取时间10，20，30，40，50 min时油菜籽粕黄酮的提取量。

1.5.5 料液比的选择

固定硫酸铵用量0.2 g/mL，乙醇浓度40%，提取温度50 ℃，提取时间30 min，超声功率240 W，考察料液比1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50(g/mL)时油菜籽粕黄酮的提取量。

1.5.6 超声功率的选择

固定硫酸铵用量0.2 g/mL，乙醇浓度40%，提取温度50 ℃，提取时间30 min，料液比1∶30(g/mL)，考察超声功率200，240，280，320，360 W时油菜籽粕黄酮的提取量。

1.6 正交试验

在单因素试验的基础上，选取硫酸铵用量、提取温度、提取时间、料液比、超声功率5个对油菜籽粕黄酮提取量影响较大的因素，通过正交试验设计软件L16(45)设计正交试验，优化油菜籽粕黄酮的最佳工艺条件并进行试验验证。

1.7 抗氧化活性

参考文献[15]的方法，以抗坏血酸作对照，考察油菜籽粕黄酮对·OH和O2-·的清除能力。

·OH清除率(%)=(A样品-A损伤)/(A未损-A损伤)×100；

O2-·清除率(%)=[A0-(A样品-A1)]/A0×100。

式中：A0表示自由基溶液的吸光度值；A样品表示测定样品的吸光度值；A1表示测定油菜籽粕黄酮溶液自身的吸光度值；A损伤表示只加自由基溶液的吸光度值；A未损表示不加入样品和过氧化氢溶液的吸光度值。

1.8 统计学分析

所有数据均为测定3次、取平均值，采用Origin 7.5软件进行统计分析，结果以平均值±标准偏差表示。采用F检验对正交试验结果进行差异显著性分析，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 乙醇浓度对油菜籽粕黄酮提取量的影响。

图1 乙醇浓度对油菜籽粕黄酮提取量的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of total flavonoids from rapeseed meal

由图1可知，在硫酸铵质量浓度一定的条件下，黄酮提取量随着乙醇浓度的增加而逐渐增加，当乙醇浓度达到40% 时，黄酮提取量达到最高值，而后黄酮提取量随着乙醇浓度的继续增加而下降。分析原因可能是当乙醇浓度较小时，溶剂的极性较高；随着乙醇浓度的增加，溶剂的极性逐渐降低，因此黄酮提取量随之逐渐增加，而当乙醇浓度大于40%时，溶剂的极性过低，从而导致总黄酮提取量反而开始降低。结合双水相体系的稳定性，本研究体系固定乙醇浓度为40%进行其他参数的选择。

2.1.2 硫酸铵用量对油菜籽粕黄酮提取量的影响。

由图2可知，随硫酸铵用量的增加，油菜籽粕黄酮的提取量呈现先增加后降低的趋势，0.3 g/mL时达到最大值。可能原因是硫酸铵质量浓度可以改变两相中物质的组成和相比，从而影响油菜籽粕黄酮在乙醇相中的分配；当硫酸铵浓度过大时，在双水相体系中有少量硫酸铵固体析出，导致黄酮提取量逐渐下降。故硫酸铵的浓度确定为0.3 g/mL。

图2 硫酸铵浓度对油菜籽粕黄酮提取量的影响Fig.2 Effect of ammonium sulfate concentration on the extraction rate of total flavonoids from rapeseed meal

2.1.3 提取温度对油菜籽粕黄酮提取量的影响。

图3 提取温度对油菜籽粕黄酮提取量的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on the extraction rate of total flavonoids from rapeseed meal

由图3可知，随提取温度的增加，油菜籽粕黄酮提取量出现先增加，再稳定在一定水平后出现下降的趋势。当提取温度在40～60 ℃时，黄酮提取量稳定在(5.07±0.06)mg/g，随着提取温度的延长，油菜籽粕黄酮提取量出现下降，可能是由于超声辅助提取温度的升高，促使部分黄酮发生分解、氧化等反应，或上层乙醇相中黄酮的分解程度大于下层硫酸铵相中的分解程度导致双水相体系发生变化。故选择提取温度为50 ℃为宜。

2.1.4 提取时间对油菜籽粕黄酮提取量的影响。

由图4可知，随着提取时间的增加，油菜籽粕黄酮提取量呈现先上升后下降的趋势，30 min时达到极值。这主要是由于长时间的超声波作用促使某些黄酮类成分发生缩合、氧化或降解等反应而被破坏，使含量降低。故选择30 min为最佳的提取时间。

图4 提取时间对油菜籽粕黄酮提取量的影响Fig.4 Effect of extraction time on the extraction rate of total flavonoids from rapeseed meal

2.1.5 料液比对油菜籽粕黄酮提取量的影响。

图5 料液比对油菜籽粕黄酮提取量的影响Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of total flavonoids from rapeseed meal

由图5可知，随着料液比的变化，油菜籽粕黄酮提取量呈现先上升后下降缓慢的趋势。当料液比为1∶20(g/mL)时，油菜籽粕黄酮提取量为(5.31±0.07)mg/g。原因是提取液的增多，促使提取溶液与油菜籽粕充分接触，促使黄酮溶出，1∶20(g/mL)时达到极值；继续增多提取溶剂，油菜籽粕中黄酮的溶出达到饱和或一些醇溶性杂质竞争性浸出促使黄酮提取量下降且变化缓慢。故选择料液比为1∶20(g/mL)为宜。

2.1.6 超声功率对油菜籽粕黄酮提取量的影响。

由图6可知，油菜籽粕黄酮提取量随超声功率的变化而变化，280 W时达到最大值，继续加大超声功率，黄酮提取量逐渐降低。可能是由于超声波的机械效应促使一些黄酮活性成分发生降解、聚合等反应促使提取量下降，故选择超声功率为280 W。

图6 超声功率对油菜籽粕黄酮提取量的影响Fig.6 Effect of ultrasonic power on the extraction rate of total flavonoids from rapeseed meal

2.2 油菜籽粕黄酮双水相提取工艺正交试验优化

依据单因素试验结果，结合双水相体系的稳定性，固定乙醇浓度为40%。正交试验设计及结果见表1，方差分析结果见表2。

表1 正交试验设计及结果分析Table 1 The experimental design and results of orthogonal test

表2 正交试验结果的方差分析Table 2 Variance analysis of orthogonal test results

注：P<0.05，“*”表示影响显著。

由表1可知，硫酸铵浓度(A)、提取温度(B)、提取时间(C)、料液比(D)和超声功率(E)对油菜籽粕黄酮提取量均有一定的影响，其影响大小次序为：A>E>D>B>C，最优工艺条件为A2B2C3D3E3，即硫酸铵浓度0.3 g/mL，提取温度40 ℃，提取时间30 min，料液比1∶30 (g/mL)，超声功率280 W。由表2方差分析结果可知，硫酸铵浓度和超声功率对油菜籽粕黄酮提取量的影响最为显著。

2.3 最优工艺及验证试验

依据油菜籽粕黄酮提取工艺的最优组合为A2B2C3D3E3，进行3组平行实验，得到油菜籽粕黄酮的平均提取量为(5.53±0.03) mg/g。与正交试验表中最大黄酮提取量相比，表明该油菜籽粕黄酮提取工艺稳定可行，从而确定最优工艺条件为：乙醇浓度40%，硫酸铵浓度0.3 g/mL，提取温度40 ℃，提取时间30 min，料液比1∶30 (g/mL)，超声功率280 W。

2.4 油菜籽粕黄酮的抗氧化活性研究

2.4.1 对羟基自由基(·OH)的清除

油菜籽粕黄酮和Vc对·OH的清除能力试验结果见图7。

图7 油菜籽粕黄酮和Vc对·OH的清除能力Fig.7 Scavenging effect of flavonoids and Vc from rapeseed meal on ·OH

由图7可知，随着样品浓度的增加，油菜籽粕黄酮和Vc对·OH的清除能力逐渐增强。在样品浓度为0.0504 mg/mL时，油菜籽粕黄酮对·OH的清除能力明显弱于Vc溶液。随着样品浓度升高，0.0504～0.1008 mg/mL时油菜籽粕黄酮对·OH的清除率呈现快速上升趋势，0.1008～0.1344 mg/mL时，清除率上升缓慢。当总浓度为0.1344 mg/mL时，油菜籽粕黄酮对·OH的清除率为89.6%，而相同浓度下的Vc对·OH的清除率为99.2%，总体而言，油菜籽粕黄酮对·OH具有一定的清除活性。结果表明油菜籽粕黄酮的抗氧化活性远不及还原能力较强的抗坏血酸。

2.4.2 对超氧阴离子自由基(O2-·)的清除

油菜籽粕黄酮和Vc对O2-·的清除活性实验结果见图8。

图8 油菜籽粕黄酮和Vc对O2-·的清除能力Fig.8 Scavenging effect of flavonoids and Vc from rapeseed meal on O2-·

由图8可知，油菜籽粕黄酮在低浓度条件下，对O2-·的清除能力与Vc近似。随着2种样品浓度升高，油菜籽粕黄酮对超氧阴离子的清除能力呈现明显的量效关系，0.084～0.168 mg/mL时，清除率上升缓慢；当加入油菜籽粕黄酮浓度为0.294 mg/mL时，其清除率达到稳定值(86.9±0.25)%。当总浓度为0.378 mg/mL时，油菜籽粕黄酮对超氧阴离子的清除率为87.3%，而相同浓度下的Vc对超氧阴离子的清除率为91.6%。结果表明油菜籽粕黄酮对O2-·的清除率清除活性弱于抗坏血酸。

3 结论

本试验以油菜籽粕为原料，以黄酮得率为评价指标，在单因素结合正交试验的基础上，超声辅助乙醇-硫酸铵双水相提取并优化工艺。结果表明：油菜籽粕黄酮的最优提取工艺组合为A2B2C3D3E3，即硫酸铵浓度0.3 g/mL，提取温度40 ℃，提取时间30 min，料液比1∶30 (g/mL)，超声功率280 W，油菜籽粕黄酮的平均提取量为(5.53±0.03)mg/g。体外抗氧化活性研究表明，油菜籽粕黄酮提取液对·OH和O2-·均具有一定的清除活性，且随着油菜籽粕黄酮质量浓度的增加，清除率均逐渐增加。当油菜籽粕黄酮质量浓度为0.1344 mg/mL时，其对·OH的清除率为89.6%；当油菜籽粕黄酮质量浓度为0.378 mg/mL时，其对超氧阴离子的清除率为87.3%，均弱于同浓度条件下Vc的清除能力。

本研究证明了油菜籽粕黄酮含量较高且具有一定的体外抗氧化活性，由于油菜籽粕利用率较低，大部分作为废弃物处理，本研究为油菜副产品的综合开发与利用提供了一定的实验依据。