改善纳豆风味与营养特性工艺的对比研究

，*，，，，

(1.四川大学 轻纺与食品学院，成都 610065；2.四川徽记食品股份有限公司，成都 610065)

纳豆是日本传统的发酵食品，经纳豆芽孢杆菌发酵而成，富含小分子氨基酸、寡聚糖和有机酸等多种易被人体吸收的营养物质，同时也含有纳豆激酶、苷元型异黄酮和维生素K2等多种生物活性物质，对预防和治疗血栓和骨质疏松等具有较好的作用[1-4]。但是枯草芽孢杆菌在发酵后，由于蛋白酶的作用会使蛋白质在分解成氨基酸的同时产生具有不良风味的氨味物质，因而降低了消费者对纳豆的接受度。

对此，已有大量文献报道了如何降低纳豆中氨味物质的含量。陈文珊等的研究发现在向原材料中加入3%的味精和10∶1的姜汁后，再经发酵所得的纳豆产品香气、硬度适宜，并且拉丝性好，氨味含量明显降低[5]；董岳峰等的研究报道显示当薏米和黄豆的质量比为2∶8时，由于薏米的糖质和大豆中的蛋白质转化为了纳豆的碳水化合物，故而产品的黏液较多、气味芳香，口感得到了大幅提升[6]；金虎等的研究表明当纳豆芽孢杆菌和乳酸菌的接种体积比为1∶1.6时不仅对纳豆激酶的分泌有促进作用，而且可以明显改善纳豆风味和降低游离氨基的含量[7]。目前的研究均只是单一地从改变菌种、原料配比和添加调味料方面来改变或掩盖纳豆产品的氨味，而对2种或2种以上方式改善纳豆风味与营养特性的对比研究鲜有报道。

因此，本研究旨在通过感官评价结合对挥发性盐基氮、氨基酸态氮含量和纳豆激酶活性的测定分别选出传统发酵方式、复合菌种发酵方式和复合原料发酵方式中的最佳工艺条件，最后对比复合菌种发酵产品和复合原料发酵产品与传统发酵产品和市售纳豆产品对比，获得一种既能满足中国人感官嗜好又能保留纳豆更多营养成分的工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 实验原料与试剂

小金黄690珍珠粒黄豆、圆江糯米：成都市沃尔玛超市；市售3种纳豆D，E，F：京东商城；纳豆芽孢杆菌、植物乳杆菌：中国工业微生物菌种保藏中心；氢氧化钠、甲醛、盐酸、氧化镁、硼酸、甲基红、溴甲酚绿、乙醇、福林试剂、碳酸钠、三氯乙酸、硼酸钠、酪蛋白、L-酪氨酸：均为分析纯；蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、甘露醇、吐温80、K2HPO4·7H2O、三水醋酸钠、柠檬酸三铵、MgSO4·7H2O 、MnSO4·4H2O、琼脂粉、NaCl：蜀都仪器有限公司。

1.1.2 仪器

LDZF-75L立式高压蒸汽灭菌器 上海申安仪器有限公司；DZKW-4电子恒温水浴锅、DL-1电热炉、DH-420电热恒温培养箱 北京中兴伟业仪器有限公司；FA-25匀浆机 上海弗鲁克流体机械制造有限公司；78-1磁力搅拌器 上海双捷仪器有限公司；BMS-220分析天平 上海卓精电子科技有限公司；SW-CJ-1D落地式洁净工作台 上海力辰邦西仪器科技有限公司；QSY全自动凯氏定氮仪 上海新家仪器有限公司；UV-6000PC紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司；GY-A228N超低温冰箱 上海仙象仪器仪表有限公司；MP511 Lab pH Meter 上海三信仪表厂。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基的制备

1.2.1.1 植物乳杆菌种子培养基

蛋白胨3.5 g，牛肉膏1.75 g，酵母粉1.4 g，甘露醇7 g，吐温80 0.35 mL，K2HPO4·7H2O 0.7 g，三水醋酸钠1.75 g，柠檬酸三铵0.7 g，MgSO4·7H2O 0.07 g，MnSO4·4H2O 0.0175 g，琼脂粉5.25 g，将上述成分加入到350 mL蒸馏水中，pH调至6.5。

1.2.1.2 纳豆芽孢杆菌种子培养基

蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 5 g/L，pH值7.2。

1.2.2 种子液的制备

先将保藏于-80 ℃冰箱中的纳豆芽孢杆菌和植物乳杆菌从冰箱中取出，放置于40 ℃水浴锅中复苏(50～100 s)，再分别于无菌操作台上转接于LB和MRS斜面培养基上，然后分别放入28，37 ℃恒温培养基中培养24 h，得到活化的菌株，完成第1代活化。挑取活化后的纳豆芽孢杆菌于纳豆芽孢杆菌种子培养基中进行摇瓶培养，培养温度37 ℃，搅拌转速200 r/min，培养时间14 h；挑取活化后的植物乳杆菌于种子培养基中进行静置培养，培养温度37 ℃，培养时间24 h，完成活化。

1.2.3 传统发酵制作工艺流程

1.2.4 操作说明

1.2.4.1 小黄豆浸泡时间

选择颗粒饱满、大小均匀的小黄豆10 g分别置于250 mL烧杯中，洗净，然后放入30 mL室温的清水，静置，直到其体积为浸泡前的2.2～2.5倍。

1.2.4.2 蒸煮

将浸泡好的小黄豆放入高压杀菌锅中，在121 ℃，100 kPa条件下蒸煮20 min。蒸煮后豆粒易被手捏碎为宜。

1.2.4.3 冷却

无菌环境下冷却至室温(不烫手为宜，或40 ℃以下即可)。

1.2.4.4 接种

去除不饱满和涨裂的小黄豆，将纳豆芽孢杆菌菌液(按干黄豆质量计)按照5.0%，8.0%，11.0%，14.0%分别加入小黄豆中搅拌均匀，分别标记为A1，A2，A3，A4。

1.2.4.5 发酵

将接好种的原料用消毒过的纱布盖好，放入恒温、恒湿箱中，温度为40 ℃，湿度约为80%，发酵时间为22 h。

1.2.4.6 低温后熟

在4～5 ℃的低温条件下后熟24 h，使产品风味更佳，然后放入-20 ℃冰箱中冷冻保藏。

1.2.4.7 产品保藏

将制作好的纳豆产品置于-20 ℃环境下保藏。

1.2.5 复合菌种发酵制作工艺

除在发酵时分别接种5.0%，8.0%，11.0%，14.0%的纳豆芽孢杆菌和植物乳杆菌的混合菌液(按干黄豆质量计，混合比为1∶1)外，其他操作步骤均相同。样品编号为B1，B2，B3，B4。

1.2.6 复合原料发酵制作工艺

除原材料按照糯米和小黄豆质量比为1∶9，2∶8，3∶7或4∶6添加和纳豆芽孢杆菌的接种量参考传统发酵中最优接种量加入外，其他操作步骤均相同。样品编号为C1，C2，C3，C4。

1.2.7 纳豆感官指标的测定

纳豆感官评价的标准见表1，采用百分制，测定指标包含色泽、气味、口感和粘滞性。

表1 纳豆感官评价评分标准Table 1 Scoring criteria for sensory evaluation of natto

1.2.8 氨基酸态氮含量的测定

参考GB 5009.235—2016的酸度计法测定[8]。

1.2.9 挥发性盐基氮的测定

参考GB 5009.228—2016的方法测定[9]。

1.2.10 纳豆激酶活性的测定

参考GB/T 23527—2009的福林法测定[10]。

1.3 数据处理与分析

采用SPSS V19.0和Microsoft Excel统计软件计算出3次重复测量所得的平均值，以平均值±标准差的形式表达，并进行ANOVA分析和Duncan显著性检验，不同显著性数据用不同字母标记。

2 结果与分析

2.1 不同发酵方式对纳豆感官品质的影响

不同发酵方式对纳豆感官品质的影响见表2。

表2 不同发酵方式对纳豆感官品质的影响Table 2 Effects of different fermentation methods on the sensory quality of natto

续 表

注：大写字母D，E，F分别表示3种市售纳豆。

制品好的纳豆菌胎是半透明到透明状，菌胎厚且完全覆盖豆粒。搅拌后黏液多且呈半透明至透明状，豆粒完整，无大量破损。放置后纳豆表面具有光泽，且用筷子挑起，丝不断，具有纳豆特有的风味[11]。

以色泽、气味、口感和粘滞性4个指标对3种不同发酵工艺进行感官评价，结果表明：传统发酵方式中，当纳豆杆菌的菌液添加量为14.0%时其综合评分最高，制得的纳豆产品呈浅黄色，口感酥软，较为湿润且黏液多，拉丝长，效果较好，但是其氨味较重，消费者对其的接受性不是很好；在发酵剂改为复合菌液发酵时，当添加量为5.0%时其感官综合评分最高，制得的产品颜色呈金黄色，有一定光泽，略带有氨味，口感湿润酥软且拉丝效果好，消费者较能接受；改变原材料配比，当糯米和小黄豆的添加量为2∶8时，纳豆的感官评分值最高，制得的纳豆产品颜色呈金黄色，有一定光泽，具有纳豆和糯米特有的香味，氨味不是很明显，口感湿润酥软且拉丝效果好，消费者大多能接受。对市售3种纳豆产品的结果分析表明3种纳豆呈金黄色，有一定光泽，氨味较重，口感湿润酥软且拉丝效果好，消费者接受性较弱。

综上所述，通过感官品评人员对产品的品评发现，传统发酵制得纳豆的可接受性低于其他2种发酵工艺；市售纳豆的感官评分值偏低，由此可推测多数人购买纳豆的可能原因是纳豆具有一定的营养保健功能，而对口感要求较低[12]。

2.2 传统发酵方式对纳豆品质的影响

传统纳豆制作需经过浸泡、蒸煮、冷却、接种、发酵和后熟工艺，接种的是单一菌种——纳豆菌[13]。纳豆营养丰富，100 g纳豆的蛋白质量相当于80 g肉或3个鸡蛋。纳豆不仅对原豆的营养成分有所保留，而且在发酵时大量的大豆蛋白转化成易吸收的多肽和氨基酸，并且产生许多对人体有益的功能活性物质，例如纳豆激酶、纳豆黄酮和维生素K等。但是蛋白在分解为小分子氨基酸的同时也会产生一些氨味物质，影响口味。为了平衡营养和口味，文章对氨基酸态氮、挥发性盐基氮和纳豆激酶活性进行了测定。

表3 传统发酵方式对纳豆品质的影响Table 3 Effect of traditional fermentation method on the quality of natto

注：表中数据为平均值±标准差，同列上标字母不同表示差异显著(p<0.05)，下同。

由表3可知，随着纳豆芽孢杆菌菌液添加量的增加，氨基酸态氮的含量不断增加，当纳豆芽孢杆菌菌液添加量为14.0%时，氨基酸态氮含量最高，为0.35 g/100 g，各组间差异不显著(p>0.05)；分析原因是当以一定含量蛋白为原料时，纳豆芽孢杆菌菌液添加量越大，对蛋白质的分解越多，因而测得的氨基酸态氮值也越大。在发酵中期，氨会由氨基酸分解产生，质量良好的纳豆应尽量减少氨的产生，实验中通过测定挥发性盐基氮来检测氨含量的变化[14]，由表3可知，挥发性盐基氮的含量也随着纳豆芽孢杆菌菌液添加量的不断增加而降低，分析原因可能是接种量影响发酵程度，而发酵程度又直接与生物胺含量相关[15]。不同于其他指标，纳豆激酶活性呈现出先增加后降低的趋势，纳豆芽孢杆菌菌液接种量为11.0%时纳豆激酶活性最高，分析原因是当接种量低时菌体生长速度慢，影响了正常代谢，而接种量过高时会导致发酵水分分布不均，发酵放热，温度升高，无法准确控制发酵温度，进而会影响一些活性物质的产生。

综上所述，在传统发酵方式中，当纳豆芽孢杆菌菌液的添加量为14.0%时，制得的产品氨基酸态氮含量最高，而挥发性盐基氮值最小；因为A3和A4组测得的纳豆激酶值间差异不显著(p>0.05)，因此当纳豆芽孢杆菌菌液的添加量为14.0%时，既可获得较好口感又可达到高营养的要求。

2.3 复合菌种发酵方式对纳豆品质的影响

纳豆由于产生碱性物质——小分子挥发性盐基氮而有明显氨味，而植物乳杆菌恰好在发酵过程中会产生酸，二者产物综合，可降低含氮物质的产生，从而达到改善纳豆风味的目的。

因而，本研究考察了将植物乳杆菌和纳豆芽孢杆菌互配发酵，互配菌种的添加量对纳豆发酵品质的影响见表4。

表4 复合菌种发酵方式对纳豆品质的影响Table 4 Effect of complex strains fermentation method on the quality of natto

续 表

由表4可知，氨基酸态氮随着混合菌种添加量的增加而不断增加，但组间差异不显著(p>0.05)，当混合菌种添加量为14.0%时氨基酸态氮值最大。现已有文献表明：纳豆发酵过程中约55%的蛋白质分解成水溶性氮化物，其中10%为游离氨基酸[16]，而且其含量与纳豆风味直接相关，其高低可作为纳豆产品品质和生产工艺的关键控制点；挥发性盐基氮随着混合菌种添加量的增加而不断增加，分析原因可能是当混合菌种添加量为5.0%时，两菌种可较好地发挥协同作用，其中植物乳杆菌可降解组氨酸、精氨酸等产生杂醇并与发酵过程中产生的酸性物质发生中和反应产生酯类，对产品风味有改良作用；而后期菌粉增加由于二者竞争利用营养物质，影响了自身生长和代谢[17,18]。随着混合菌种添加量的增加，纳豆激酶活性不断减小，组间差异显著(p<0.05)；当混合菌种的添加量为5.0%时，纳豆激酶活性最高，为350.78 U/g，分析原因可能是过多地接种纳豆菌和植物乳杆菌的混合菌液不仅会使菌种间协同作用不能发挥，而且也会由于二者竞争利用营养物质，导致纳豆激酶产量降低[19,20]。

综上所述，当混合菌种的添加量为5.0%时，制得的产品既可获得较好口感又可达到高营养的要求。

2.4 复合原料发酵方式对纳豆品质的影响

糯米与小黄豆的营养成分含量不同，尤其是影响纳豆风味的氨基酸态氮含量不同，因而改变原料配比能够从根本上改善纳豆的风味。改变发酵配比的本质是改变碳氮比，一方面克服了单纯添加香精香料和调味剂来掩盖纳豆氨味的局限性，另一方面不同原料营养价值不同也为纳豆在医疗保健品的进一步开发提供了重要途径。

表5 复合原料发酵方式对纳豆品质的影响Table 5 Effect of mixed materials fermentation methodon the quality of natto

氨基酸态氮指以氨基酸形式存在的氮元素含量，其含量越高，营养越好[21]。由表5可知，随着糯米占比的增加，氨基酸态氮的含量不断减少，但是C2组分别与C1，C3和C4组间差异不显著(p>0.05)；因为糯米中的含氮量低于小黄豆，而氨基酸态氮的产生主要是纳豆菌发酵产生蛋白酶，因此底物减少，自然产物也相应降低[22]。挥发性盐基氮在原料配比为2∶8时，挥发性盐基氮值最小，而后又增加，分析原因可能是糯米的糖质含量高于小黄豆，在纳豆的发酵过程中，糯米糖质与小黄豆的蛋白质转化为产品纳豆的碳水化合物，因而减少了游离氨的形成，从而改善了纳豆风味；而后期增加可能是糯米较黏、易结团，减少了与纳豆菌的接触面，影响了发酵，因而应该控制好糯米的加入量[23]。纳豆激酶在原料配比为2∶8时活性最高，且与其他3组相比差异显著(p<0.05)，其值为382.32 U/g。

综上所述，在原料配比为2∶8时，挥发性盐基氮含量最小，而纳豆激酶活性最高；又因为原料配比为2∶8时实验所测氨基酸态氮与其他3组相比差异不显著(p>0.05)，因而为保证制得的产品既可获得较好口感又可达到高营养的要求，可选择原料配比为2∶8。

2.5 3种发酵方式对纳豆品质影响的对比

在单因素试验的基础上筛选出的3种不同发酵方式最佳作用水平下制得的纳豆与市售的3种纳豆氨基酸态氮、挥发性盐基氮和纳豆激酶的测量结果见表6。

表6 3种发酵方式对纳豆品质影响的对比Table 6 Effect of three fermentation methods on the quality of natto

由表6可知，市售纳豆的挥发性盐基氮含量始终高于实验室自制的3种纳豆；而市售纳豆的纳豆激酶活性始终低于实验室自制的3种纳豆。仅对实验室自制纳豆所测定的指标对比分析发现：复合原料发酵方式可以很好地降低挥发性盐基氮含量，且与其他2种方式相比减少了2倍之多，差异显著(p<0.05)；与此同时，复合原料发酵方式组测得的纳豆激酶活性最高，其值为382.32 U/g，差异显著(p<0.05)，综合考虑，实验室自制纳豆中改变原料配比发酵方式制得的纳豆品质较好。观察市售3种纳豆的测量数据发现：E纳豆的挥发性盐基氮含量最低，纳豆激酶活性最高，而氨基酸态氮值与其他市售纳豆相比差异不显著(p>0.05)；故3种市售纳豆中E纳豆最好。最后将实验室自制纳豆中改变原料配比发酵组纳豆与市售E纳豆对比分析，发现二者氨基酸态氮值差异不显著(p>0.05)，实验室自制纳豆的挥发性盐基氮含量低于E纳豆，而纳豆激酶活性高于E纳豆。

由表2感官分析结果可知， C2和E的感官评分值分别为82分和70分，再结合表6分析可知，与传统发酵方式相比，复合菌种和复合原料2种发酵方式都可以较好地改善纳豆风味和营养物质，这一研究结果与齐凤元等和王瑞珍等的研究结果相一致，并且复合原料发酵方式制得的纳豆品质优于市售纳豆[24,25]。

3 结论

本实验通过感官评价结合对挥发性盐基氮、氨基酸态氮含量和纳豆激酶活性的测定，以传统菌种发酵方式为对照，研究了改变菌种发酵方式和改变原料配比发酵方式对纳豆品质的影响，并与市售的3种纳豆做比较，通过分析得到以下研究结论：通过与传统发酵方式对比发现，复合菌种和复合原料2种发酵方式都可以较好地改善纳豆风味和营养物质，但复合原料发酵方式组中当糯米与小黄豆之比为2∶8时效果最好，且其品质优于市售的纳豆。