噬菌体展示布鲁氏菌基因文库插入效率鉴定

于凌娇，张履冰，王阔鹏，刘倩宏

布鲁氏菌病的诊断方法主要包括流行病学调查、临床诊断、病理变化、细菌学和血清学诊断[1]。血清学方法有快速准确等诸多优越性，是国际上最常用的诊断方法。但其不能用于区分动物的天然感染和后天免疫。且一些其它革兰氏阴性细菌，如大肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌 、沙门氏菌等亦有类似的脂多糖 O-链结构，与布鲁氏菌存在严重的血清学交叉反应，易产生假阳性。因此，新型诊断抗原的筛选成为关键[2]。

实验室前期建立噬菌体展示布鲁氏菌16M株基因组文库，拟从该文库中筛选具有良好抗原性的诊断制剂，为新型诊断方法建立奠定基础。本研究利用Touch-down PCR技术对建立的文库进行评价，检测文库插入片段的随机性及多样性，为后续试验奠定基础。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料与主要仪器

噬菌体展示马耳他布鲁氏菌16M株基因组文库(本实验室前期构建)；无菌水；Taq MasterMix(购自康为世纪生物有限公司)；标准DNA marker；质粒pYW01。pYWF、pYWR(长春库美生物公司合成)。

LB液体培养基(含20 μg/mL氯霉素)：称取胰蛋白胨0.5 g，酵母提取物0.5 g，NaCL 0.25 g，用去离子水定容补足体积至50 mL。加热融化，用1 mol/L NaOH溶液调节PH至偏碱性。待蒸汽灭菌后，将培养基放置水浴锅中，待温度降至40 ℃左右添加氯霉素以20 μg/mL的终浓度添加于培养基中。

LB固体培养基(含20 μg/mL氯霉素)：称取胰蛋白胨2 g，酵母提取物2 g，NaCL 1 g，琼脂糖4 g，用去离子水定容补足体积至500 mL。待蒸汽灭菌后，将培养基放置水浴锅中，待温度降至40 ℃左右添加氯霉素以20 μg/mL的终浓度添加于培养基中。冷却之前倒板保存。

1%琼脂糖凝胶电泳上样缓冲液：取EDTA 4.4 g，溴酚蓝250 mg，二甲苯腈蓝FF250 mg，溶于200 mL蒸馏水加热搅拌溶解。加入180 mL甘油后，用NaOH调PH至7.0。蒸馏水定容至500 mL，分装保存。

1%琼脂糖凝胶：称取0.3 g琼脂糖置于锥形瓶中，加入30 mL 1×TAE缓冲液，瓶口倒扣小烧杯，微波炉加热煮沸至琼脂糖全部融化溶液澄清透明为止，大约需2 min，取出摇匀，冷却至60 ℃以下，加入2 μL EB，摇匀。(注意：一定要等冷却至60 ℃以下再加入EB，EB高温挥发致癌性较强，全程要戴手套操作。)

PCR扩增仪(BIO-RAD 621BR28014 Made in Singapore );超净台(北京东联哈尔仪器制造有限公司BSC-1100ⅡA2)；稳压电泳仪(北京君意东方电泳设备有限公司JY3OOE)；摇床(上海领成生物科技有限公司TC-200B)；凝胶成像仪(Prism LPMPL230-12070010)；无菌恒温培养箱(Thermol)。

1.2 试验方法

1.2.1 复苏噬菌体展示布鲁菌基因组文库 取出-80 ℃保存的基因文库，用接菌环蘸取适量菌液，涂布于LB固体平板(含 20 μg/mL 的氯霉素)；静置于37 ℃恒温培养箱中过夜培养，次日观察菌落形态；并挑取单菌落导入到5 ML新鲜LB液体培养基中(含 20 μg/mL 的氯霉素)，37 ℃180 rmp 条件下摇动培养12-16 h，此即为复苏布鲁氏菌基因组文库。

1.2.2 检测布鲁菌基因组文库容量 将新鲜的布鲁氏菌基因组文库菌液10倍比稀释，并将不同稀释倍数菌液分别涂布于LB固体培养基中(含 20 μg/mL 的氯霉素)。37 ℃静置培养过夜。次日观察单菌落个数，按照以下公式计算基因文库容量。菌落数(cfu/ mL)=单菌落数×稀释倍数×100。

1.2.3 引物设计及合成 根据pYW01质粒序列，利用primer 5.0设计引物，引物序列如下：

上游引物(F)5′AACATATGAAATACCTGCTGCCGAC 3′；下游引物(R)5′TCTTCCTCAGAGATCAGCTTCTGCT 3′。(引物由长春库美生物公司合成)。

将合成好的引物放入离心机瞬离然后放入超净台内，关闭风机，轻轻打开装有引物的离心管，取37 μL 蒸馏水轻缓稀释。(注意：打开离心管要轻，防止引物跑出去)。

1.2.4 PCR体系及运行条件建立 由于插入质粒pYW01中的外源片段大小在0.3-2.0 kb之间，因此建立的文库为随机文库。因此，我们利用Touch-down PCR方法对不同大小质粒进行扩增。

Touch-down PCR反应体系如下：

图1 PCR检测结果1泳道为10000marker，条带大小如图所示; 2-17泳道为 PCR 鉴定结果。

Touch-down PCR运行条件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30sec，65 ℃30sec，72 ℃ 1 min，其中退火温度从65 ℃依次降落到50 ℃，温度每降一度运行两个循环，最后50 ℃运行10个循环，共计40个循环。

1.2.5 布鲁氏菌基因组文库插入效率及随机性检测 以pYWF、pYWR为上下游引物，利用Touch-down PCR对基因文库进行扩增，检测其插入效率及随机性。

以1%琼脂糖凝集电泳检测结果。将制胶板洗净晾干，置于水平位置，并放好样品梳子。将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液缓缓倒入制胶槽内。待胶凝固后，取出梳子，将胶槽放在已倒好电泳缓冲液的电泳槽中进行点样。

取5 μL样品溶液和2 μL上样缓冲液，混匀后，加入样品孔中。加5 μL marker于另一孔。上样完毕后，调电泳仪各参数(U：80 V；A；200 A；T：40 min)进行电泳，凝胶成像系统观察结果。

2 试验结果

2.1 基因组文库容量检测

观察培养布鲁氏菌基因组文库菌液平板上， 共生长了约26个单菌落， 则库容量检测结果为：26×100

×100=2.6×105pfu/mL。达到建库要求，进行文库插入效率及随机性检测。

2.2 布鲁氏菌基因组文库插入效率及随机性检测

以布鲁氏菌16M基因组文库为模板进行1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，如图1所示。

由图1可见，第2、4、5、7、8、9、11、13、14、15、16、17泳道为阳性，且阳性条带位置大小不一，插入效率达到75%以上。结果表明片段成功高效插入噬菌体载体pYW01中，且插入的片段大小不一，具有较好的随机性。结果表明，实验室前期构建的噬菌体展示布鲁氏菌16M株基因组文库具有良好的插入效率及随机性，满足建库要求，符合后续筛选需要。

3 讨 论

为了筛选出布鲁氏菌新型诊断抗原，为该病诊断方法的完善奠定基础。实验室前期利用噬菌体展示技术构建了布鲁氏菌16M株基因组文库，以满足实验大范围的筛选需要。为检测实验前期构建文库的随机性及多样性，本研究利用Touch-down PCR对构建的噬菌体展示布鲁氏菌基因组文库进行评价[3]。

传统PCR方法退火温度越低，引物和底物越容易结合，错配情况增多，造成PCR特异性降低，产物混入预期外片段[4]。退火温度高则会引起扩增效率下降,甚至无扩增产物出现。Touch-down PCR也称降落PCR。其原理是，选定一个退火温度范围，随着退火温度的降低，特异性逐渐降低，但在较高温度下特异带已被放大，其浓度远高于非特异性带，并且随着退火温度的降低，特异带优先扩增[5]。 Touch-down PCR程序与传统PCR程序相比能够很好的避免使用复杂基因组模板时非特异性PCR产物的出现，不仅提高了目的基因组模板的相对特异性，还具有分辨率高、重复性好等优点，可以敏感、准确、快速地鉴定基因组文库插入效率，满足本试验临床大规模筛选和检测的需要[6]。

因引物大小为100bp，且由于插入质粒pYW01中的外源片段为随机大小，因此建立的文库为随机文库，且插入序列大小在0.3-2.0kb之间。以布鲁氏菌16M基因组文库为模板进行1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果所示第3、6、10、12泳道条带为阴性，第2、4、5、7、8、9、11、13、14、15、16、17泳道为阳性，且阳性条带位置大小不一，插入效率达到75%以上。(注：第2、3、4、5、7泳道上为引物二聚体，第7、8、15泳道上出现两条条带，是引物特异性的问题，不影响结果的分析)，结果表明，实验室前期构建的布鲁氏菌16M株基因组文库具有良好的多样性及随机性，满足建库要求，符合后续筛选需要[7-8]。

4 结 论

研究通过PCR技术对实验室前期构建的布鲁氏菌基因组文库进行评价，根据电泳图谱表明；插入片段大小数量不一。结果表明；插入片段具有良好的随机性及多样性。