大花杓兰根际土壤真菌及兰科菌根真菌多样性分析

付亚娟，张 剑，付琦媛，侯晓强*

(1.廊坊师范学院 生命科学学院，河北 廊坊 065000；2.河北省高校食药用菌应用技术研发中心，河北 廊坊 065000；3.廊坊职业技术学院，河北 廊坊 065000)

【研究意义】大花杓兰(CypripediummacranthumSw.)，隶属兰科杓兰属，是集观赏价值和药用价值于一体的地生兰植物。近些年，由于过度采挖及栖息地的破坏，我国野生大花杓兰种群数量急剧下降[1]。大花杓兰与绝大多数兰科植物一样，也是典型菌根植物，其成熟种子萌发、幼苗生长均与菌根真菌密切相关，但有关大花杓兰菌根真菌的研究报道较少。研究大花杓兰根际土壤真菌及潜在兰科菌根真菌群落的组成对于大花杓兰的保育具有重要意义。【前人研究进展】侯晓强等[2]采用组织分离方法对北京和吉林大花杓兰内生真菌进行研究，发现北京大花杓兰优势菌群为毛壳菌属(Chaetomium)和茎点霉属(Phorna)，而吉林大花杓兰内生真菌优势菌群为毛壳菌属(Chaetomium)真菌。张毓等[3]从大花杓兰根系中分离到一株瘤菌根菌属(Epulorhiza)真菌，并证实该真菌能有效促进大花杓兰种子萌发。Shimura等[4]研究也证实瘤菌根菌属真菌能促进大花杓兰(Cypripediummacranthosvar.rebunense)种子萌发，但相对于幼苗及原球茎，来自成株的瘤菌根菌属真菌具有更高的促萌发率。张亚平[5]研究发现，鸡油菌目(Cantharellales)内生真菌对大花杓兰原球茎的生长发育有促进作用。【本研究切入点】最新研究发现，兰科植物特异的菌根真菌主要分布在其成株周围土壤，其菌根真菌的丰度随距兰科植物地理距离增加而下降[6-7]。大花杓兰作为兰科植物保护中的“旗舰类群”，其根际土壤真菌及潜在兰科菌根真菌的相关研究目前尚未见报道。【拟解决的关键问题】本研究采用克隆文库技术对北京百花山野生大花杓兰根际土壤真菌及潜在兰科菌根真菌的群落组成进行初步分析，旨在为将来分离筛选大花杓兰种子共生萌发菌及野生种群迁地保育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 土壤样品采集

2017年6月份，对北京百花山国家级自然保护区(东经115°25′～115°42′，北纬39°48′～ 40°05′)的大花杓兰根际土壤进行采样。大花杓兰是濒危兰科植物，所以本研究将大花杓兰须根系表面0～3 cm范围内5～15 cm土层的土壤视为其根际土壤。采样方法采取五点混合采样法。将五点采集的根际土样分别装在无菌自封袋中，当天带回实验室。所有土壤样本过2 mm筛后，等量充分混匀，置于-80 ℃冰箱中保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 土壤宏基因组DNA的提取 采用土壤DNA提取试剂盒(FastDNA SPIN Kit for Soil，USA)对土壤宏基因组DNA进行分离，其操作按照试剂盒说明书进行。所提取DNA的完整性采用0.7 %琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.2.2 土壤真菌ITS序列的PCR扩增 以提取的土壤DNA为模板，采用特异引物ITS1-OF和ITS4-OF[8]对大花杓兰根际土壤真菌ITS序列进行PCR扩增。PCR反应体系为25 μl：2×PCR Master 12.5 μl，DNA模板2 μl，引物ITS1-OF和ITS4-OF(10 μmol/L)各1 μl，BSA(25 mg/mL)2 μl，最后加ddH2O至25 μl。PCR程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，60 ℃复性30 s，72 ℃延伸45 s，共35个循环；72 ℃最后延伸10 min。1.0 %琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测。

1.2.3 土壤真菌ITS序列的克隆及测序 将3次扩增的PCR产物混合后，采用PCR产物纯化试剂盒(生工，上海)进行纯化回收，其操作按照试剂盒说明书进行。将上述纯化的PCR产物与克隆载体pGM-T(天根，北京)进行连接，连接产物转化EscherichiacoliTOP10感受态细胞(天根，北京)。经蓝白斑筛选及菌落PCR验证后，随机挑选100个阳性克隆送上海生工测序，测序引物为载体pGM-T上通用引物T7。

1.2.4 序列分析、OUT分类及系统发育分析 将测序得到的所有ITS序列首先采用Chromas软件打开，观察峰图，排除双峰序列，获得良好DNA序列；而后通过Dnastar7.1去除载体冗余序列；基于97 %序列相似水平划分可操作分类单元(operational taxonomic units，OTU)[9]。对于每个OUT，随机选取一条代表性序列，该序列通过与GenBank中已有序列进行Blastn比对，以确定ITS序列所对应的物种分类地位。综合兰科植物菌根真菌多年的研究报道，确定潜在的兰科菌根真菌OUT及代表的ITS序列。参照盖雪鸽等[10]的方法，构建兰科菌根真菌OUT的分子系统发育树，确定其亲缘关系及分类地位。

2 结果与分析

2.1 大花杓兰根际土壤真菌类群分析

从大花杓兰根际土壤真菌ITS克隆文库中随机选取100个阳性克隆，经测序、去除载体冗余序列及校对后，获得96个有效的真菌克隆。其中44个克隆为未知真菌(45.83 %)，接合菌门真菌14个克隆(14.58 %)，子囊菌门真菌7个克隆(7.29 %)，球囊菌门和壶菌门真菌各1个克隆(1.04 %)，其余均为担子菌门真菌，占克隆总数的30.22 %(图1)。

图1 大花杓兰根际土壤真菌群落相对丰度Fig.1 Relative abundance of C. macranthum rhizosphric fungi at phylum level

除了未知真菌，其他52个真菌克隆基于97 %的同源相似性水平，将其划分为24个操作分类单元(表1)。它们可以归纳为3类，第1类是序列同源相似性>=98 %，可以鉴定到具体的属或种，共10个OTUs，占克隆总数的51.93 %，分别为OTU2、OTU5、OTU10、OTU13、OTU14、OTU15、OTU17、OTU18、OTU20、OTU23。第2类是可以鉴定到具体的属或种，但序列比对相似性<98 %，推测其可能为已知序列的近缘类群，涉及OTU1、OTU6、OTU7、OTU8、OTU9、OUT16、OTU21、OTU22，占克隆总数的32.69 %。第3类是不能确定其具体分类地位，只鉴定到细菌门、纲、目和科，共6个OTUs，包括OTU3、OTU4、OTU11、OTU12、OTU19、OTU24，占克隆总数的15.38 %。

由表1显示，所获得的24个真菌操作分类单元(OTUs)中，14个担子菌，5个子囊菌，3个结合菌，1个壶菌和1个球囊菌。担子菌分属于5目9科9属，其中4个OTUs(OTU1-4)属于鸡油菌目Cantharellales，其最匹配的序列分别为丝核菌属Rhizoctonia、角担菌属Ceratobasidium和胶膜菌科Tulasnellaceae；与OTU9最匹配序列为糙孢孔目Trechisporales的粗糙孔菌属Trechispora；OTU13最匹配序列是线黑粉菌目Filobasidiales的Solicoccozyma属；OTU14最匹配序列是伏革菌目Corticiales的拟射脉菌属Phlebiella；除了2个OTUs(OTU11和OTU12)只鉴定到伞菌纲和伞菌目，其余5个OTUs最匹配的序列依次属于伞菌目Agaricale的小菇属Mycena(OTU7)、湿伞属Hygrocybe(OTU5和OTU6)、粉褶蕈属Entoloma(OTU8)和小脆柄菇属Psathyrella(OTU10)。已鉴定的子囊菌中，除了OTU19鉴定到子囊菌门，其余4个OTUs分属于3目4属，2个OTUs(OTU15和OTU16)属于格孢腔菌目Pleosporales的壳二孢属Ascomycota和Chaetosphaeronema属；另2个OTUs(OTU17和OTU18)分别属于煤炱目Capnodiales的亚球壳属Sphaerulina和纵裂菌目Hysteriales的Psiloglonium属。接合菌的3个OTUs(OTU20-22)均属于被孢霉目Mortierellales的被孢霉属Mortierella。与OTU23最匹配的序列是壶菌门Chytridiomycota的根生壶菌属Rhizophydium；与OTU24最匹配的序列为球囊菌门Glomeromycota的多孢囊霉科Diversisporaceae。

表1 大花杓兰根际土壤菌根真菌OTUs列表

注：A代表子囊菌门；B代表担子菌门；C代表壶菌门；G代表球囊菌门；Z代表接合菌门。

Note: A represents Ascomycota; B represents Basidiomycota; C represents Chytridiomycota; G represents Glomeromycota; Z represents Zygomycota.

图2 大花杓兰根际土壤真菌群落相对丰度Fig.2 Relative abundance of rhizosphric fungi on C. macranthum

2.2 根际土壤真菌类群相对丰度分析

本研究共获得96个真菌克隆，分属于5门6纲11目16科15属。从“目”这一分类层次来看，优势真菌类群主要分布在被孢霉目Mortierellales、伞菌目Agaricales和鸡油菌目Cantharellales，其所占比例总和达到39.58 %；其次是格孢腔菌目Pleosporales(3.12 %)、糙孢孔目Trechisporales(2.08 %)和煤炱目Capnodiales(2.08 %)(图2A)。从“科”分类水平来看，被孢霉科Mortierellaceae(14.58 %)最为丰富，其次是角单菌科Ceratobasidiaceae(8.33 %)和蜡伞科Hygrophoraceae(6.25 %)，再次是胶膜菌科Tulasnellaceae(3.12 %)和粉褶菌科Entolomataceae(3.12 %)(图2B)。在“属”水平上，相对丰度(>2 %)的8个属所占比例总和达到38.52 %，相对丰度最大的5个属依次为被孢霉属Mortierella(14.58 %)、湿伞属Hygrocybe(6.25 %)、角担菌属Ceratobasidium(5.21 %)、丝核菌属Rhizoctonia(3.12 %)和粉褶蕈属Entoloma(3.12 %) (图2C)。

2.3 大花杓兰根际土壤兰科菌根真菌分析

由表1显示，对24个大花杓兰根际土壤真菌OTUs进行分析，发现4个OTUs(OTU1-4)可能为潜在的兰科菌根真菌。从GenBank中下载与每个OTU(OTU1-4)最相似的序列，用Mega5.1构建菌根真菌系统发育树(图3)。大花杓兰根际土壤真菌分为3枝，其中一进化枝为角担菌科Ceratobasidiaceae，包括2个OTUs(OTU1和OTU2)，另2个进化枝为胶膜菌科(Tulasnellaceae Ⅰ 和Tulasnellaceae Ⅱ)各包含1个OUT，分别为OTU3和OTU4。根据真菌群落相对丰度(图2B和2C)，发现大花杓兰根际土壤中兰科菌根真菌在科水平上主要为Ceratobasidiaceae真菌；在属水平上，优势菌群为角担菌属Ceratobasidium真菌。

3 讨 论

根际微生物是植物微生态系统的重要组成部分，微生物群落的组成及丰度与植物生长发育、土传病害的发生发展密切相关。研究濒危兰科植物大花杓兰根际微生物的群落组成对于大花杓兰的保育具有重要意义。本研究采用克隆文库技术对大花杓兰根际土壤真菌群落多样性进行初步分析，结果发现大花杓兰根际土壤中担子菌为优势类群，所获得的24个OUTs中，担子菌14个OUTs，占OUT总数的58.33 %；子囊菌5个OUTs，接合菌3个OUTs，壶菌门和球囊霉门真菌各1个OUT。从“目”层次来看，优势真菌类群为被孢霉目、伞菌目和鸡油菌目；从“科”分类水平来看，被孢霉科最为丰富，其次是角单菌科和蜡伞科，再次是胶膜菌科和粉褶菌科。在“属”水平上，相对丰度(>3 %)的4个属依次为被孢霉属、湿伞属、角担菌属和丝核菌属。从生态功能上讲，24个OUTs中有6个OTUs为植物菌根真菌，其中兰科菌根真菌4个(OTU1-4)，外生菌根真菌2个(OTU7-8)。

图3 基于ITS序列的角单菌科和胶膜菌科真菌系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree for the Ceratobasidiaceae and Tulasnellaceae (OTU1-4) based on rDNA-ITS sequences

兰科植物为典型的菌根植物，通常认为生活在兰科植物内的菌根真菌与宿主协同演化，形成了互惠共生关系。也有观点认为，兰科菌根真菌的生长可以不依赖宿主，但兰科植物从种子萌发到幼苗生长都高度依赖菌根真菌，甚至有些兰科植物在整个生命周期都依赖菌根真菌[11-12]。尽管兰科菌根共生机制仍存在争议，但都体现了菌根真菌对兰科植物生长发育的重要性。本研究发现大花杓兰根际土壤潜在的兰科菌根真菌是担子菌的胶膜菌科Tulasnellaceae和角单菌科Ceratobasidiaceae真菌，它们均已被证实为大多数热带、温带兰科植物菌根真菌的优势类群[11]。Shefferson等[13]研究发现，胶膜菌科Tulasnellaceae真菌是来自欧洲和北美7种杓兰属植物(Cypripediumcalceolus,Cypripediumcalifornicum,Cypripediumcandidum,Cypripediumfasciculatum,Cypripediumguttatum,Cypripediummontanum,Cypripediumparviflorum)的主要菌根真菌，偶见角担菌科Ceratobasidiaceae和蜡壳耳科Sebacinaceae真菌。缪福俊等[14]研究结果表明，胶膜菌属真菌对滇西北4个不同居群的黄花杓兰(Cypripediumflavum)具有一定的寄主专一性。角担菌科也在很多兰科植物的菌根真菌中占主导地位[15-16]。Oja等[17]研究发现，二叶舌唇兰(Platantherachlorantha)和四裂红门兰(Orchismilitaris)周围土壤中潜在的兰科菌根真菌(蜡壳耳目Sebacinales、胶膜菌科Tulasnellaceae和角单菌科Ceratobasidiaceae)，也同样存在于它们的根中，只是相对丰度不同。土壤中蜡壳耳目真菌占优势，而角单菌科和胶膜菌科分别为P.chlorantha和O.militaris的优势类群。对比Oja等[17]的研究结果，发现大花杓兰根际土壤未检测到蜡壳耳目Sebacinales菌根真菌，可能由于不同种兰科植物及土壤环境影响菌根真菌组成。

除了占主导地位的胶膜菌科和角担菌科外，本研究还检测到了粗糙孔菌属Trechispora、小脆柄菇属Psathyrella、被孢霉属Mortierella、湿伞属Hygrocybe等潜在菌根真菌类群的存在。粗糙孔菌属真菌作为兰科植物菌根真菌的研究报道较少，Huang等[18]报道该属真菌可能为蝶兰Phalaenopsis的菌根真菌。小脆柄菇属Psathyrella也被认为与兰科植物相关，但在兰科菌根研究中作为偶见种类[19]。据零星报道，大花杓兰根际土壤中占绝对优势的被孢霉属Mortierella也被认为是潜在兰科菌根真菌，它可能通过促进植物根系吸收矿质元素或抑制病原菌，进而促进兰科植物生长发育[20]。湿伞属Hygrocybe曾在外生菌根真菌研究中有发现[21]。小菇属Mycena和粉褶菌属Entoloma分别作为兰科菌根真菌和外生菌根真菌已有报道[22]，但本研究发现OUT7和OUT8分别与GenBank中Mycenaacicula(JF908384)和Entolomasubserrulatum(KY706168)的序列相似性仅为85 %和87 %，推测它们可能为小菇属和粉褶菌属的近缘物种。因此在这里没有将小菇属和然粉褶菌属划分到菌根真菌进行讨论。

近年来，兰科植物周围土壤中兰科菌根真菌的研究备受关注。Waud等[6]研究发现，与兰科植物共生的菌根真菌广泛分布于土壤中，但菌根真菌群落组成的变化与近端宿主植物密切相关。Oja等[17]也取得与Waud相似的研究结果，发现土壤中潜在的兰科菌根真菌也存在兰科植物的根中，但菌根真菌相对丰度不同。Voyron等[23]的研究结果表明，与兰科植物相关的某些菌根真菌类群在土壤中未被发现。鉴于大花杓兰根际土壤潜在兰科菌根真菌的相关研究目前尚未见报道，因此本研究通过分子手段，对其根周围土壤真菌类群及潜在兰科菌根真菌进行初步分析，发现土壤中潜在的兰科菌根真菌为鸡油菌目的角单菌科和胶膜菌科真菌。综合上述研究报道，认为大花杓兰根周围土壤中菌根真菌，在一定程度上能反映其根内的菌根真菌类群。另外，已有研究表明，鸡油菌目真菌能促进大花杓兰原球茎的生长和发育[5]，而胶膜菌科的瘤菌根菌属真菌对大花杓兰种子有促萌发作用[3-4]。因此，推测角单菌科和胶膜菌科真菌可能为大花杓兰重要的菌根真菌，其研究结果将为大花杓兰的保育和人工繁殖提供理论依据。

4 结 论

本研究采用克隆文库技术对濒危兰科植物大花杓兰根际土壤真菌及兰科菌根真菌群落组成进行初步分析，发现被孢霉属Mortierella为大花杓兰根际土壤真菌的优势类群；根际土壤中所检测到的潜在兰科菌根真菌为胶膜菌科Tulasnellaceae、角担菌科Ceratobasidiaceae的丝核菌属Rhizoctonia和角担菌属Ceratobasidium真菌。