大花铁线莲花芽分化研究

熊阳阳，和文志，于文剑，高鹏华，王 锦*

(1.西南林业大学 园林学院，云南 昆明 650224；2.西南林业大学 生命科学学院，云南 昆明 650224)

被誉为“攀援植物皇后”的铁线莲隶属毛茛科(Ranunculaceae)铁线莲属(Clematis)，多为落叶木质藤本。花两性或单性，组成聚伞花序或单生；萼片花瓣状，着色丰富；无花瓣；雄蕊多数，心皮多数。大花铁线莲品种因其花型大而多样、萼瓣颜色丰富等特点应用极为广泛，其通常为单被花，萼瓣5～8枚；也有一些为重被或半重被品种，只有极少数完全重被。大花铁线莲品种分为早花组和晚花组，早花品种花期2次，萼瓣上有清晰脉纹，第1个主花期的花朵开放于头年老枝，花芽在秋季霜冻前就已经完成，春季到来腋芽处会长出新的枝条。晚花品种花开放在当年新枝上，花量充沛，但萼瓣上无清晰脉纹[1]。【研究意义】大花铁线莲重被品种具有重要的观赏园艺地位和研究价值。重瓣型栽培品种的研究工作对今后植物品种的应用推广具有现实意义，而重被大花铁线莲品种花形多样，部分品种在不同季节表现为重被与单被的特性为探究重被花的形成机制提供了很好的研究素材。【前人研究进展】目前关于大花铁线莲重被品种的研究仅有栽培技术[2-3]及组织培养[4-6]等方面的报道，大花铁线莲花器官发育的研究也限于单被品种[7-8]。【本研究切入点】以3种花被类型(单被、重被、完全重被)的大花铁线莲品种为试材，采用常规石蜡切片法和显微技术对其花芽分化过程进行观察分析。【拟解决的关键问题】初步阐明大花铁线莲重被花的起源方式，为研究铁线莲重被花形成机制奠定形态学基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为西南林业大学铁线莲种质资源圃内3种花被类型(单被、重被、完全重被)的大花铁线莲品种“朱卡”(C.‘Julka’)，“薇安”(C.‘Vyvyan Pennell’)、“蓝光”(C.‘Blue Light’)。试验观测时间2017年3-10月，每隔6 d取材1次，随机采取顶芽或上节位叶腋处的花芽数个。

1.2 试验方法

1.2.1 样品固定与保存 将所采花芽放入50 % FAA中固定，抽气2 h后置于室温下保存备用。

1.2.2 脱水 采用酒精梯度浓度法脱水。具体程序为：70 %乙醇→85 %乙醇→95 %乙醇→叔丁醇→叔丁醇，各梯度脱水时间间隔30 min。

1.2.3 浸蜡与包埋 材料脱水完成后重新加入叔丁醇与碎蜡(1∶1)放入60 ℃恒温箱过夜。第2天倾去原蜡液后倒入纯蜡液，共换2次，每次间隔1 h。待牛皮纸盒底部蜡略凝时将材料切面朝下填入。

1.2.4 切片与粘片 修整蜡块，用KD-3358 切片机切片，厚度为8 μm。将粘有切好的蜡带的载玻片放入40 ℃的展片台上。玻片自然风干5～7 d。

1.2.5 脱蜡与染色 将晾好的切片依次放入二甲苯→酒精→二甲苯中进行脱蜡，每次5 min。番红过夜，固绿30 s。

1.2.6 封片 切片取出后用中性树胶封固，待3～5 d后显微镜观察拍照。

2 结果与分析

2.1 开花生物学特性观察

从花的构造来看，铁线莲与其他植物最主要的区别在于它的‘花’不是由花瓣组成，而是萼片瓣化构成了花的形态。严格意义上讲，铁线莲是没有花瓣的，植物学家们将这种花瓣状的萼片称为“萼瓣”[1]。由于萼瓣数的不同，铁线莲的花显现出单瓣、半重瓣及重瓣3种不同的形态。本次研究选用铁线莲不同花瓣类型的代表品种作为供试材料，为研究铁线莲重被花的形态发育提供更加严谨的理论依据。

薇安(C.‘Vyvyan Pennell’)为早花大花型品种。高2.5～3 m，花深蓝紫色，花蕊白色，花药米黄色多数，花径18～22 cm。叶长约8 cm，宽5 cm，花梗长约6 cm。花期2次，晚春重瓣或半重瓣花开于老枝上，萼瓣数多可达70枚；早秋单被花开于当年新枝，萼瓣数6～9枚。据花期观测记录初花日期在3月20日，终花期在9月25日前后。

蓝光(C.‘Blue Light’)为早花大花型重被品种。高2～2.5 m，花中央雌雄蕊都完全瓣化，形成莲座状的完全重被花，花色浅蓝，花蕊米黄色，萼瓣多数，花径10～14 cm，叶长约5 cm，宽3 cm，花梗长约6 cm。花期2次，老枝新枝均开重被花。初花日期约在3月5日，终花期在9月20日前后。

朱卡(C.‘Julka’)为早花大花型单被品种，高2～2.5 m，花平盘单瓣形，紫罗兰色，萼瓣6～8枚，中间有深紫红色条带，雄蕊亮白色和紫色多数。花径12～15 cm，叶长约5 cm，宽2.5 cm，花梗长约3 cm。初花日期约在3月25日，终花期在9月初，花期1次，长达4个月。

2.2 花芽分化时期观察

2.2.1 花芽分化前期 顶芽内分生组织的细胞活动开始活跃，其营养生长锥呈尖圆状。在茎尖生长点的基部、生长锥两侧产生的突起即叶原基。生长锥随着花芽的生长表面积逐渐变大，叶原基接着向上伸长进行分化[7]。3个大花铁线莲品种的花芽分化前期生长锥形态差异不大，‘薇安’的生长锥顶端较圆，基部较大(图2)。

A：薇安；B：蓝光；C：朱卡A: Clematis.‘Vyvyan Pennell’; B: Clematis.‘Blue Light’; C: Clematis.‘Julka’图1 3种铁线莲供试材料Fig.1 Test materials of three kinds of clematis

A：薇安花芽分化前期；B：蓝光花芽分化前期；C：朱卡花芽分化前期；GC：生长锥(顶端分生组织)；LP：叶原基A:Early flower bud differentiationof C.‘Vyvyan Pennell’; B:Early flower bud differentiation of C.‘Blue Light’; C:Early flower bud differentiation of C.‘Julka’; GC: Growth cone (apical meristem); LP: Leaf primordium图2 不同大花铁线莲的花芽分化前期Fig.2 Early flower bud differentiation of different large flower clematises

2.2.2 花芽分化初期 在花芽分化初期，突起的生长点先端变的宽而肥大，呈近半球状向上隆起。花原基是在生长点的顶端进行分化，当植物生长发育到一定阶段时由于分生组织活动进入生殖生长，茎顶端分生组织横径加大，逐渐由尖变平[7]，进而转向花的分化形成花原基(图3)。

2.2.3 萼片原基分化期 开始分化的顶端分生组织变宽，花原基的两侧有小突起产生，形成萼片原基。铁线莲“花瓣”由花瓣状萼片分化而来，这个时期可称之为花被原基的分化期(图4)。

A：薇安花芽分化初期；B：蓝光花芽分化初期；C：朱卡花芽分化初期；FP：花原基A: The beginning of the flower bud differentiation of C.‘Vyvyan Pennell’；B: The beginning of the flower bud differentiation of C.‘Blue Light’；C: The beginning of the flower bud differentiation of C.‘Julka’; FP: Flower primordium图3 不同大花铁线莲的花芽分化初期Fig.3 The beginning of the flower bud differentiation of different large flower clematises

A：薇安萼片原基分化期；B：蓝光萼片原基分化期；C：朱卡萼片原基分化期；CaP：萼片原基A: Sepal primordium differentiation stageof C.‘Vyvyan Pennell’; B: Sepal primordium differentiation stageof C.‘Blue Light’; C: Sepal primordium differentiation stageof C.‘Julka’; CaP: Sepal primordium图4 不同大花铁线莲的萼片原基分化期Fig.4 Sepal primordium differentiation stage of different large flower clematises

2.2.4 雄蕊原基分化期 随着萼片原基的伸长，在萼片原基内侧基部显示出新的背腹形态，雄蕊原基形成。萼片发育时紧紧包裹花原基所产生的挤压使得刚发生的几枚雄蕊原基呈三角状，随着雄蕊原基的向心发生和数目不断增多，雄蕊原基的螺旋状序列逐渐明显，花原基形状均呈半球状突起[8](图5)。

2.2.5 雌蕊原基分化期 萼片原基此时期已分化成为花瓣状萼片，部分雄蕊原基分化成雄蕊，在萼片和雄蕊原基的内侧，花托顶端中央向上部分出现多个突起，即雌蕊原基。此时雄蕊由小而圆的花瓣状物变得宽大扁平，形成花瓣状。雌蕊原基经发育分化成雌蕊(图6)。

2.2.6 重被与完全重被品种雄雌蕊瓣化形成期 相较于大花铁线莲单被品种朱卡，重被品种薇安与完全重被品种蓝光在雄蕊原基和雌蕊原基已经分化形成雄蕊和雌蕊后，会发生瓣化现象。重被品种薇安雄蕊瓣化，而雌蕊保持原有形态。完全重被品种蓝光雌雄蕊均瓣化，且雄蕊先于雌蕊瓣化(图7)。

A：薇安雄蕊瓣化形成；B：蓝光雄雌蕊瓣化形成；0：胚珠；St：雄蕊； Pi：雌蕊A: Stamen petaloidof C.‘Vyvyan Pennell’; B: Stamen and pistil petaloid of C.‘Blue Light’; 0: Ovule; St: Stamen; Pi: Pistil图7 重被及完全重被大花铁线莲的瓣化Fig.7 Petalody of double perianth and fully double large flower clematises

3 讨 论

自然界有丰富多彩的重瓣观赏植物，重瓣花起源方式大致分为6种，即积累起源、苞片起源、雌雄蕊起源、台阁起源、重复起源和花序起源。雌雄蕊瓣化从形态上表现为雌雄蕊从外向内减少或退化，花瓣数增加，花瓣由外向内逐渐变小，直到出现花瓣和雄蕊的过渡形态，有些还有花丝或花药的痕迹，或者仅花丝变成花瓣状[9]。早年Lehmann和Sattler对毛茛科红类叶升麻(Actaearubra)花发育的研究发现，萼片内方二轮10个雄蕊原基在发育过程中可发育成花瓣，也可以形成雄蕊，即花瓣和雄蕊可以互相取代，证明了毛莨科的内花瓣可能起源于雄蕊[10]。植物光合日变化与其生理生态因子受内外环境的影响会有所不同[11]，植物花瓣的重瓣性表型是遗传物质和环境因子共同作用的结果[12]。以大花铁线莲重被品种薇安为典型代表的开花特性(晚春至早夏开重被花，在早秋二次开单被花)就是如此。

4 结 论

大花铁线莲重被花和完全重被花为典型的雌雄蕊起源方式。大花铁线莲的花芽分化顺序都是由外向内进行，其过程可分为花芽分化前期、花芽分化初期、萼片原基分化期，雄蕊原基分化期和雌蕊原基分化期；完全重被品种蓝光在雄蕊雌蕊成形后产生瓣化现象。通常雄蕊先于雌蕊发生瓣化，而重被品种薇安仅雄蕊瓣化。观赏植物的花朵重瓣程度高低对其观赏效果有极大的影响，大花铁线莲花形特征和变化方式是其重要的观赏特性，也是研究花器官发育与形成机制的理想材料。本研究初步阐明大花铁线莲重被花的起源方式，关于影响大花铁线莲重被花形成的主要环境因素及适值、可能控制铁线莲重被花形成的相关基因的筛选及基因克隆与表达分析等问题还有待进一步探究。