不同生长年限白及的多糖组织化学定位研究

朱新焰，字淑慧，唐 宇，张智慧，杨竹雅，石亚娜，钱均祥，孙信梅，王家金，季鹏章*

(1.云南省农业科学院药用植物研究所，云南 昆明 650205；2.云南农业大学，云南 昆明 650201；3.云南中医药大学，云南 昆明 650500；4.彝良县农业技术推广中心，云南 彝良 657600)

【研究意义】白及[Bletillastriata(Thunb.) Reichb. f.]为兰科白及属多年生草本植物。现为《中国药典》(2015年版) 收载的常用中药[1]。白及具有理肺、止血消肿等功效，主要用于治疗肺结核及咳血、吐血和外伤肿痛及胃溃疡病等症[2]。多糖是白及的主要有效成分，目前，白及以新鲜或干燥的假鳞茎入药，叶、茎、根等部位则是弃而不用，造成了资源的严重浪费。同时，白及也是一种药用价值高、需求量大、野生资源稀缺甚至濒危，并且参伪十分严重的重要药用植物。故白及植株的各器官值得深入研究，挖掘其有用部位，以减少资源和有效成分的浪费。【前人研究进展】组织化学定位技术在中药材鉴定及化学成分分布特征和积累规律等方面研究有着重要用途[3-6]。对白及的研究主要集中在资源分布和假鳞茎多糖成分提取分离等方面[7-10]。目前，尚未见对白及和本属植物多糖的组织化学定位的研究报道；而兰科石斛属植物的组织化学定位研究的报道则较多[11-12]。【本研究切入点】采用植物显微的组织化学方法，研究不同生长年限白及的多糖分布积累特征，发掘白及各器官多糖蕴藏量，拓展资源利用范围。【拟解决的关键问题】对白及多种器官进行多糖定性定量分析，揭示不同生长年限的药材多糖分布场所和特征，为白及类药用植物的叶、茎、根等部位的综合开发利用提供科学的参考依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

一年生、两年生和三年生白及的根、假鳞茎、茎、叶均采自云南省农业科学院药用植物研究所药材种植基地。

1.2 药品与仪器

盐酸、高碘酸、品红、亚硫酸氢钠、甲醇、乙醇、偏重亚硫酸钠等为分析纯或试剂纯试剂。主要仪器有：Nikon 80i显微镜，Nikon E100显微镜，FA1004电子分析天平等。

1.3 方法

1.3.1 染色试剂的配制 将碱性品红溶于热蒸馏水中，使之充分溶解，待溶液冷却至50 ℃时过滤，再冷却到25 ℃时加入盐酸和亚硫酸氢钠，放置暗处，静置24 h后，加活性炭摇荡，过滤后保存于冰箱中备用，呈浅黄色。

1.3.2 切片制作、固定 净选不同生长年限白及的各器官进行徒手切片，选取细胞组织结构清晰、完整的切片染色。将组织切片用75 %乙醇溶液进行固定，比较不同固定时间后染色的效果。

1.3.3 染色 将选好的组织切片放入1.0 % HIO4水溶液中处理5～10 min后，用蒸馏水清洗3遍。再将不同方法固定的切片分别放入2种Schiff试剂内进行染色，设置染色时间梯度，选择最适宜的染色时间进行实验。染色结束以后，用偏重亚硫酸钠溶液洗涤数次。制片在显微镜下进行观察和拍照。

1.3.4 数据分析 随机选取不同样品的9～12张切片，在显微镜下进行观察统计，各相同器官切片选取3个不同观察视野；根据不同器官，观察面积设为4×104～12×104μm2；统计分析各视野中的多糖数量，取平均值。根据细胞着色程度及颗粒物的多少和分布密度依次分为5个等级，从低到高分别用1个“+”到5个“+”表示。

2 结果与分析

2.1 多糖组织化学定位方法优化结果

2.1.1 固定时间 通过对切片用75 %乙醇溶液进行不同时间的固定后发现，25～30 min时间段内，固定效果较好，选取25 min对切片进行固定，条件优化结果见表1，图1。

2.1.2 染色时间 不同染色时间的实验结果显示，染色25～40 min 时，细胞及组织着色较好，层次清晰，多糖物质显示明显。考虑到低年限生长白及的组织发育情况，所以选取染色时间为25 min，染色时间优化结果见表2，图2。

a：固定20 min (40×)；b：固定25 min (40×)a: Fixed time of 20 min (40×); b: Fixed time of 25 min (40×)图1 不同固定时间效果比较Fig.1 Comparison results of different fixed time

固定时间(min)Fixed time颗粒状多糖数量Polysaccharide quantity固定时间(min)Fixed time颗粒状多糖数量Polysaccharide quantity5+30+ + + + +15+ + +40+ + + +20+ + + +60+ +25+ + + + +120-

表2 染色时间的优化结果

2.2 白及根、假鳞茎、茎、叶内多糖的分布及定量分析

在不同年限的白及根中，多糖分布在维管束及皮层薄壁细胞中，并且这些部位细胞壁染色较深，其它位置有少量分布。3年生的根部多糖分布较多，1年生及2年生的较少，见表3、图3。

在白及假鳞茎内，多糖主要在皮层薄壁组织、维管束及其鞘细胞中，多数呈颗粒状或小团块；皮层薄壁细胞、韧皮部、木质部及维管束鞘细胞的细胞壁、细胞质染色较深。该部位多糖数量随生长年限的增多而升高，见表3、图4。

白及茎中的多糖主要分布在皮层薄壁组织及细胞内、维管束及其鞘细胞的细胞壁和细胞质中，呈小颗粒状，总体呈现分布较均匀，数量也有随生长年限增加而升高的趋势，见表3、图5。

白及叶中多糖主要分布在叶肉细胞中，维管束及其鞘细胞也有分布。该部位多糖数量仅次于假鳞茎，多呈小团块或颗粒状；并且，颗粒随着生长年限延长而增大。见表3、图6。

结合生长年限及4种不同器官分析，含糖量最高的是假鳞茎，其次为叶片，根和茎最低。各器官多糖的数量范围为观察3个面积相同(12×104μm2)的不同视野的平均值；各图展示的是该年限各器官的代表性的着色及多糖显微特征，主要显示的是多糖集中的薄壁细胞等组织。

a：染色15min (40×)；b：染色25 min (40×)a: Dyeing time of 15 min (40×); b: Dyeing time of 25 min (40×)图2 不同染色时间效果比较Fig.2 Comparison results of different dyeing time

1：薄壁细胞；2：多糖；a：1年生根；b：2年生根；c：3年生根1: Parenchyma cells; 2: Polysaccharide; a: The root of 1 year old; b: The root of 2 years old; c: The root of 3 years old图3 白及根中多糖分布情况Fig.3 Distribution of polysaccharide in the roots of Bletilla striata

1：薄壁细胞；2：多糖；a：1年生假鳞茎；b：2年生假鳞茎；c：3年生假鳞茎1: Parenchyma cells; 2: Polysaccharide; a: The pseudobulb of 1 year old; b: The pseudobulb of 2 years old; c: The pseudobulb of 3 years old图4 白及假鳞茎中多糖分布情况Fig.4 Distribution of polysaccharide in the pseudobulbs of Bletilla striata

1：薄壁细胞；2：多糖；3：维管束；4：维管束鞘细胞；a：1年生茎；b：2年生茎；c：3年生茎1: Parenchyma cells; 2: Polysaccharide; 3: Vascular bundles; 4:Bundle sheath cells; a: The stem of 1 year old; b: The stem of 2 years old; c: The stem of 3 years old图5 白及茎中多糖分布情况Fig.5 Distribution of polysaccharide in the stems of Bletilla striata

1：薄壁细胞；2：多糖；a：1年生叶；b：2年生叶；c：3年生叶1: Parenchyma cells; 2: Polysaccharide; a: The leaf of 1 year old; b: The leaf of 2 years old; c: The leaf of 3 years old图6 白及叶中多糖分布情况Fig.6 Distribution of polysaccharide in the leaves of Bletilla striata

Table 3 Quantitative analysis of polysaccharides in different tissues ofBletillastriata

生长年限Growth years多糖数量(个)Polysaccharide quantity根假鳞茎茎叶1年7～10280～4055～7143～1722年13～17433～48015～18180～2353年26～33520～56623～27268～310

3 讨 论

通过对不同生长年限的白及根、假鳞茎、茎及叶的多糖组织化学定位定量分析，每种器官各观察9～12张切片，在显微镜下进行观察统计，各相同器官切片选取3个不同观察视野区域发现，4种器官均有多糖分布，主要分布在皮层及薄壁细胞中，韧皮部及维管束鞘细胞等组织及细胞中也有分布，同时，这些组织的细胞壁、细胞质着色较深。在选育和栽培白及时，以假鳞茎等器官中薄壁细胞的数量多少作为一个重要指标，具有一定的指导意义[13]。将同一生长年限的白及各器官作比较，除一年生的根部多糖含量略高于茎外，4种器官多糖含量高低依次为：假鳞茎、叶片、茎、根。而将不同生长年限的同一器官相比较，假鳞茎、茎、叶的多糖含量均随生长年限增加而升高。在实际使用中，选择采收3年生白及的假鳞茎入药是合理的。

实验结果表明：白及叶、茎、根中均有多糖分布，特别是叶片多糖含量也很高；甚至部分样品叶片与假鳞茎中多糖含量相近似。这可能与白及叶片表面积较大，在进行光合作用时合成了较多的糖类物质有关。另外，在白及的总生物量中，叶和茎占到30 %左右，但在白及的常规使用中，是将叶片等部位弃而不用。近年来，白及资源遭到过度采挖，导致野生资源濒危；而白及需求量在逐年提高，使药材价格不断攀升，混伪品药材充斥市场。因此在实际生产中要重视白及叶片的开发利用，寻找新的药用部位，减少资源的浪费，提高白及资源的综合利用效率。

4 结 论

不同生长年限和不同器官及组织中，白及多糖的含量差异显著。组织化学定位方法可以揭示、分析白及多糖的分布场所和数量。多糖主要分布在皮层、韧皮部的薄壁细胞中，维管束中也有少量分布；以3年生白及的多糖含量最高。研究结果可为筛选高多糖的白及种质资源及其选育提供相关依据。不同器官中，白及叶片多糖数量仅次于假鳞茎。在视野观察面积均为12×104μm2下，叶片含多糖最高平均数量(3年生)达268～310个，与假鳞茎(520～566个)相比，占其数量的51 %～54 %左右。因此，应加大对白及地上部分的发掘，特别要重视叶片的综合开发与利用。研究结果可为寻找替代资源或新的药用部位提供参考依据。