藜蒿茶浸提液抑菌效果研究

曾长立，于 真，戴希刚，丁建军

（江汉大学 a.生命科学学院，湖北豆类（蔬菜）植物工程技术研究中心；b.科研处，湖北 武汉 430056）

藜蒿，又名蒌蒿、芦蒿、柳蒿、水蒿、香艾、小艾、水艾，属菊科蒿属，其原为野生植物，多分布于堤浅滩洲的潮湿地区，适应性好，抗逆性强。全草具有特殊香气，可药食两用［1］。藜蒿具有祛风湿、健脾胃、化痰、促消化、降血压血脂、缓解心血管疾病等食疗作用。近年来，人们对藜蒿中的化学成分和药理作用等表现出较大的兴趣［2］，但目前对藜蒿茶的研究甚少。藜蒿茶是新鲜藜蒿经特定加工工艺制成的茶叶。藜蒿茶开水冲泡片刻即可饮用，它有效延长了藜蒿的食用周期，大大提高了藜蒿的应用范围，使藜蒿更加便捷、高效地发挥价值。有研究表明，蒿属植物中的某些有机化合物如黄酮类化合物等具有抗病原微生物活性与抗炎活性［3］。茭蒿（Artemisia giraldii）中的4′，6，7-三羟基-3′，5′-二甲氧基黄酮和5′，5- 二羟基-3′，4′，8-三甲氧基黄酮对金黄色葡萄球菌、藤黄八叠球菌、大肠埃希菌、绿脓杆菌、变形杆菌属某些种，以及黄曲霉、绿色木霉等均有明显的抑制作用［4］；艾蒿叶的水浸剂对常见致病性皮肤真菌有抑制作用［5］，艾叶提取物通过有效抑菌作用而延长黄瓜贮藏期［6］，研究揭示艾叶挥发油主要成分为α-松油醇、β-桉叶精、α-侧柏酮、β-丁香烯、莰烯、樟脑、藏茴香酮和反式苇醇等，是艾叶抗菌的重要活性成分［7-8］。武月红［9］以黄花蒿、艾蒿、茵陈蒿、大籽蒿、蒙古蒿、林地蒿6 种菊科蒿属植物的乙醇提取物为材料进行试验，结果表明其对丁香假单胞菌、根癌土壤杆菌、马铃薯环腐病菌均有一定的抑菌作用。在藜蒿研究中，众多研究者证实了藜蒿叶片提取物具有一定的抑菌效果［9-12］。但目前为止，利用新鲜藜蒿叶片通过成茶工艺加工成的藜蒿茶是否具有抑菌效果还未见报道。因此，笔者通过正交试验设计醇提和水提方法，以藜蒿茶浸提液抑菌效果为评价值，研究最高抑菌效果浸提液的浸提条件，以期为藜蒿茶的保健功能研究提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究中的藜蒿茶材料由恩施州聪霖有限公司提供，采用藜蒿嫩叶加工制作而成；供试菌种为大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、产气杆菌、普通变形杆菌6 种。

1.2 正交设计

分别称取5 g 藜蒿茶以1∶10 料液比，按照以下浸提条件获得浸提液。1.2.1 醇提正交试验的设计 根据正交试验设计原理，综合单因素预试验结果，选取乙醇溶液体积分数（A）、浸提温度（B）、浸提时间（C）作为影响乙醇浸提藜蒿茶浸提液抑菌效果的影响因素，在单因素试验基础上采用L9（34）3 因素3 水平的正交试验法，试验因素与水平设计见表1。为防止高浓度乙醇溶液挥发，部分试验采用索氏抽提器（密闭性内循环）进行。

表1 正交试验因素与水平Tab.1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.2 水提试验的设计 水提试验分为两组，第一组：鉴于日常多用沸水冲泡茶叶，遂第一组均用沸水分别浸提1、2、4、6 h；第二组：在第一组基础上，分别用65、75、85、95 ℃蒸馏水浸提。为保持温度，试验在水浴锅内进行。

1.3 方法及最小抑菌浓度的测定

根据1.2.1 和1.2.2 获得藜蒿茶浸提液，备用。在无菌超净工作台上，将上述6 种供试菌种用适宜斜面活化，用高压灭菌过的生理盐水配制成104 ～106 CFU/mL 的菌悬液。将各种待试菌悬液吸取0.1 mL于已备好的牛肉膏蛋白胨培养基表面上，涂抹均匀，放置于（37 ± 1）℃恒温培养箱中干燥15 min。培养基均已做无菌检查，待琼脂完全凝固后，将其转移至恒温培养箱中，在37 ℃的条件下培养24 ～48 h。看有无杂菌生长，若无即可使用。

采用滤纸片法测定抑菌作用，取直径6 mm 的灭菌滤纸片（高压灭菌，120 ℃烤干），放入浸提液中浸泡48 h。取出培养皿，用无菌镊子夹取滤纸片置于培养皿中，每皿4 片，其中3 片试验样品呈等边三角形排列，中间放置1 片空白滤纸片作阴性对照，每种菌做两组平行试验。盖好培养皿，置于（37±1）℃恒温培养箱中倒置培养18 h。用游标卡尺精准测量抑菌环的直径（包含滤纸片）并记录，每张滤纸片垂直测定两次，取平均值，平行组试验排除特异项后取平均值，以此作为其抑菌效果的评价标准。

最小抑菌浓度（MIC）的测定：用无菌水将1.2.1 与1.2.2 中适宜条件下获得的浸提液稀释成若干梯度，用灭菌移液枪吸取1 mL 稀释样液于无菌培养皿中，倒入培养基混匀，再各吸取0.1 mL 各种供试菌菌悬液于培养皿表面，用涂布棒均匀涂布，盖好培养皿，置于（37 ± 1）℃恒温培养箱中倒置培养18 h。以完全无菌生长的浓度为最低抑菌浓度。以无菌生理盐水做空白对照。

2 结果与分析

2.1 醇提正交试验

乙醇提取藜蒿茶浸提液抑菌试验结果见表2。从表2 可知，不同水平组合下，抑菌环的大小存在明显差异。对于大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、产气杆菌与普通变形杆菌而言，A3B3C2组合的抑菌环分别达到最大；而A1B1C1组合对金黄色葡萄球菌与铜绿假单胞菌的抑菌环分别为最大。

表2 醇提抑菌正交试验结果Tab.2 Bacteriostatic results of orthogonal experiment of ethanol extract

对上述结果用DPS 软件进行正交试验方差分析，分析结果（表3）表明，因素A（乙醇体积分数）、因素B（浸提温度）的P值均小于0.001，说明乙醇体积分数和浸提温度对藜蒿茶抑菌效果达到极显著性影响；而因素C（浸提时间）的P值处于0.01 ～0.05 之间，说明浸提时间的长短对藜蒿茶浸提液抑菌效果也有显著性影响。各因素对抑菌效果的影响大小依次排列为B＞A＞C。

表3 正交设计方差分析Tab.3 Orthogonal design ANOVA

进一步对上述结果进行LSD 多重比较分析，结果表明，A3B3C2水平组合获得的浸提液抑菌效果最佳（表4），即90%乙醇溶液在95 ℃温度下浸提75 min 所得浸提液的抑菌效果最好。

表4 LSD 法多重比较Tab.4 Multiple comparison by LSD

2.2 水提试验结果

藜蒿茶叶在1、2、4、6 h 这4 个时间段内用蒸馏水浸提所得浸提液的抑菌环直径变化趋势见图1。结果显示，在1、2、4 h 3 个浸泡时间段内存在抑菌效果，在2 ～4 h 的时间段内抑菌效果略有下降，4 ～6 h 的时间段内抑菌效果显著下降，浸泡6 h 就不再有抑菌现象出现。可见，在浸泡时间不到2 h，抑菌效果随时间的增加逐渐增强。2 h 之后抑菌效果随时间的增加逐渐减弱，直至消失，故确定水提试验采用2 h 的浸泡时间。

图1 不同水提时间抑菌环直径变化趋势图Fig.1 Trend of diameter of bacteriostatic ring with different water extraction time

藜蒿茶叶在65、75、85、95 ℃4 个温度梯度下用蒸馏水浸提2 h 所得浸提液的抑菌环直径变化趋势见图2。结果显示，65、75 ℃下浸提液无抑菌现象。85、95 ℃下对6 种菌均有抑菌现象，且85 ℃下抑菌环直径较大，95 ℃下抑菌效果显著下降。可见，85 ℃的温度能够更好地提取出藜蒿茶叶中的抑菌物质，而95℃的温度过高，可能导致效应物挥发，故确定水提试验采用85 ℃的温度浸泡。

以上试验的空白对照均是以蒸馏水代替藜蒿浸提液作为对照，其他条件不变。空白组抑菌环不明显（ΦA≤7 mm），可以忽略不计。

图2 不同水提温度抑菌环直径变化趋势图Fig.2 Trend of diameter of bacteriostatic ring with different water extraction temperature

2.3 藜蒿茶浸提液最小抑菌浓度

通过抑菌环试验，无论藜蒿茶水提液还是醇提液均对各供试菌有良好的抑制效果。为了进一步说明抑制作用和对各菌种最小抑菌的差异，采取最小抑菌浓度试验法，结果见表5。此结果与上述研究结果一致，藜蒿茶提取液对6 种供试菌均具有抑制效果。由表5 可知，对于最小抑菌浓度（MIC），藜蒿茶水提液对铜绿假单胞菌的MIC 最大，藜蒿茶醇提液对枯草芽孢杆菌的MIC 最大；2 种浸提液对大肠埃希菌的最小抑菌浓度最低，说明藜蒿茶浸提液对大肠埃希菌的生长有很好的抑制作用，抑制效果高于对其他菌种。藜蒿茶醇提液的最小抑菌浓度普遍小于水提液，可能原因是醇提液浸提的关键化学成分含量更高，而且乙醇自身也具备抑菌作用所致。

表5 藜蒿茶浸提液对各供试菌种的最小抑菌浓度Tab.5 Minimal bacteriostatic concentration of extract of Artemisia selengensis tea to various strains

3 讨论

对野生植物藜蒿抑菌作用的研究已有报道，藜蒿原茎叶汁及其水浸提液对巨大芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等有抑制作用［13］，而且对一些肠道菌如痢疾杆菌、大肠埃希菌等在体外也有较好的抑制作用。因此，藜蒿具有潜在抑菌产品开发的价值［14］。本研究中无论醇提或水提获得的藜蒿茶浸提液对6 种试验菌种均存在抑制效果，此与以前的研究结果基本一致［12］。供试菌种包含革兰阳性菌和革兰阴性菌，试验证明其抑菌作用对革兰阳性菌和革兰阴性菌无差异。本试验适宜醇提条件为1∶10 料液比在95 ℃的温度下使用90%体积分数的乙醇溶液浸提75 min，所得的藜蒿茶浸提液的抑菌效果最好。辛欣等［15］的研究表明，适宜提取条件为90%乙醇、料液比1∶10、提取温度70 ℃、提取时间45 min，与本试验的浸提温度和时间选择条件存在差异，可能是不同地域的藜蒿品种抗菌成分存在差异所致。使用蒸馏水在85 ℃的温度下浸提2 h，所得的藜蒿茶浸提液的抑菌效果最好。进一步分析表明藜蒿茶浸提液对不同细菌均具有抑制作用，但对不同细菌的抑制效果差异并不显著，说明其具有广谱抑菌效果。抑菌环试验说明藜蒿茶含有抑菌物质，据前人报道藜蒿提取物中主要抑菌作用物质为三萜化合物和倍半萜内酯等，有消炎、抑菌作用，其中已被验证含有齐敦果酸［16］。在6 种供试菌中，藜蒿茶浸提液对大肠埃希菌的最小抑菌浓度最小，说明其对大肠埃希菌有较好的抑制作用，但其抑制作用机制及体内抑制效果有待进一步研究。